攜帶肝細胞生長因子的腺病毒感染臍帶間充質干細胞的實驗研究

張玉鎮 婁季宇△ 楊霄鵬 曾志磊 王珊珊 劉新珊 張曉明 尹紅蕾 王運良

1）鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014 2）解放軍第一四八中心醫院神經內科 淄博 255300 3）解放軍第一五九中心醫院神經內科 駐馬店 463000

近年來，細胞移植治療帕金森病（Parkinson’s disease，PD）已吸引許多研究者的關注［1］，而人臍帶間充質干細胞（mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord，hUC-MSC）因具備較多的優點已成為優先修復PD的種子細胞之一［2］。同時肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）作為一個多功能的生長因子，參與多種細胞的分化、增殖、再生、遷移及形態的發生，包括hUC-MSC［3］。據Salehi等［4］報道，HGF可能參與了帕金森病的病理生理過程。因此，將hUC-MSC和HGF結合可能會成為治療PD的一種新型方法。

本研究將hUC-MSC分離并鑒定后，感染攜帶肝細胞生長因子基因的腺病毒載體（adenoviral vector carrying HGF gene，Ad-HGF），觀察hUC-MSC內酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和多巴胺轉運體（Dopamine transporter，DAT）的表達情況，以明確在HGF過表達的情況下，hUCMSC是否有類多巴胺神經元分化的潛能，為HGF基因修飾hUC-MSC治療PD提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒毒株Ad-GFP由美國百特醫療用品公司基因治療部提供，攜帶HGF的重組腺病毒毒株Ad-HGF由本室構建；臍帶組織取自我院住院的健康產婦，所有標本的獲得均經產婦知情同意，并經醫院倫理委員會批準。F12培養基購自美國Gibco公司。DA ELISA試劑盒購自德國IBL公司。所有的抗體均購自美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSC分離培養和鑒定：足月健康新生兒臍帶用無血清F12培養基清洗殘余血液，挑出臍動靜脈后，將剩余組織剪成約2mm的組織塊，再轉至離心管中，用無血清培養基清洗數遍以去除臍帶組織表面的黏液，后轉移至25cm2的培養瓶中，添加10%胎牛血清和雙抗的F12培養基，置于細胞培養箱中5%CO2，37℃培養，待細胞從組織塊周圍爬出進行傳代培養，只取3～6代細胞用于實驗。

將細胞用無血清培養基洗滌3次后，胰酶消化制成細胞懸液（1×106mL-1），取0.1mL加入每個離心管中，再加入CD44、CD29和CD105一抗，并在黑暗條件下4℃孵育30min；然后加入熒光標記的二抗，同樣條件下孵育30min。甲醛溶液固定后，用流式細胞儀（Becton Dickinson公司）和CellQuest軟件分析細胞表面是否表達CD44、CD29和CD105。

1.2.2 重組腺病毒轉染hUC-MSC后轉染效率的測定：將hUC-MSC接種于6孔細胞培養板中，每孔5×105個細胞，待細胞生長融合至80%左右，吸出原來的培養液，用無血清無雙抗的F12洗滌3遍，分別加入MOI為50、100、150、200和400的Ad-GFP，以F12做為對照，2h后棄掉病毒液，換成完全培養基繼續培養，48h后收取細胞用流式細胞儀檢測轉染效率。

1.2.3 細胞免疫酶化學方法檢測TH和DAT的表達：將無菌蓋玻片置于細胞培養板內，Ad-HGF感染細胞不同時間點，將玻片取出；磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3×2min；4%多聚甲醛處理（室溫）20min；PBS漂洗3×2min；0.5%Txiton X-100處理（室溫）20min；PBS漂洗3×2min；3%H2O2處理15min；試劑盒中的血清封閉液，37℃封閉20min；取出甩干封閉液后加一抗，陰性對照用PBS代替一抗，37℃1～2 h或4℃過夜；PBS漂洗3×2min；加生物素標記的二抗37℃孵育30min；PBS漂洗3×2min；DAB顯色2～10min，蘇木素復染觀察。

1.3 統計學分析 使用SPSS 10.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析，所有數據以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。免疫組化結果運用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件進行分析，得到集成光學密度值（IOD）值后再進行統計學比較。

2 結果

2.1 hUC-MSC分離培養及鑒定 采用組織塊法分離hUCMSC，組織塊貼壁后3～4d后可見少數細胞從組織塊周圍爬出，細胞呈梭形，多角形，可見細胞核，隨著細胞增殖，形狀逐漸轉向典型的成纖維樣細胞。當細胞融合至90%左右，細胞呈平行排列或漩渦狀。然后按1︰2將細胞傳代。取第3代用流式細胞儀檢測細胞分子表面標志。如圖1所示，分離培養出的hUC-MSC表達間質干細胞表面標志物CD29、CD44和CD105，而不表達內皮細胞標志CD31和造血細胞表面抗原CD45。

圖1 流式細胞儀檢測hUC-MSC表面CD44、CD29和CD105的表達情況

流式細胞儀結果表明hUC-MSC表達間質干細胞分子表面標志CD44、CD29和CD105，而不表達內皮細胞標志CD31和造血細胞表面抗原CD45。

2.2 重組腺病毒可高效感染hUC-MSC 運用不同MOI（50、100、150、200和400）的Ad-GFP感染hUC-MSC，48h后流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測感染效率。結果顯示隨著MOI值的升高，感染效率逐步提高，當MOI為200時感染效率就能達到99.55%左右，但當MOI值為400時，感染效率也只有99.99%（圖2）。本研究結果表明，我們構建的腺病毒可高效感染hUC-MSC。本著細胞損傷小，所用腺病毒少，還要高感染效率的原則，接下來的實驗中腺病毒感染MOI值統一為200。

圖2 流式細胞儀檢測hUC-MSC感染效率

不同MOI（0、50、100、150、200和400）的Ad-GFP感染細胞后繼續培養48h。流式細胞儀檢測感染效率。隨著病毒滴度的變化感染效率可達99.99%。但MOI 200和400組間無明顯差異。

2.3 Ad-HGF感染后hUC-MSC細胞內TH和DAT表達逐漸增加 hUC-MSC感染Ad-HGF后，連續觀察3d，如圖3所示，hUC-MSC內TH和DAT的表達逐漸增多，隨著時間的推移，這種現象越來越明顯，同時發現細胞形態逐漸改變，轉為多邊形和不規則形，還會看到有長的突起。對免疫組化結果進行圖像分析，隨機選取10個視野得到IOD值，再進行統計學分析（圖3），結果表明對照組和Ad-HGF組間差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖3 細胞免疫酶化學方法檢測hUC-MSC感染Ad-HGF后TH和DAT的表達

hUC-MSC感染Ad-HGF后，隨著時間的推移，細胞內TH和DAT的表達逐漸增多，同時細胞形態逐漸改變，轉為多邊形和不規則形，還會看到有長的突起（如箭頭所示，左邊是TH，右邊是DAT，從上而下依次為0、3、7、10d）。

圖4 圖像分析軟件分析細胞免疫酶化學結果

對細胞免疫酶化學結果進行圖像分析，隨機選取10個視野得到IOD值，再進行統計學分析，結果表明對照組和Ad-HGF組間有顯著性差異（＊P＜0.01，A：TH，B：DAT）。（圖4）。

3 討論

hUC-MSC治療PD成為目前比較感興趣的話題，證據表明，hUC-MSC移植進入患者體內后表現出很強的可塑性，一定條件下，可分化成多種功能細胞。越來越多的資料證實，細胞因子、免疫和炎癥反應的產物，在帕金森病發生發展的過程中起非常重要的作用［5］。HGF作為一種多功能的生長因子，對運動神經元的發育、存活、軸突的生長和導向，以及對周圍神經損傷后神經元的保護、軸突的延長和神經纖維的修復等具有重要作用［6］。Lan等［7］發現，HGF可調控多巴胺能神經祖細胞的增殖和遷移，為治療帕金森綜合征提供新的思路。日本學者用6-羥多巴胺制作大鼠的帕金森模型，單側紋狀體內注射攜帶HGF基因的質粒，并與注射lacZ基因的質粒相對照，24周時HGF組癥狀明顯減輕，且與劑量有關。免疫組化結果發現對照組約90%的多巴胺能神經元消失，而HGF組僅減少70%左右，提示HGF過表達可以阻止帕金森大鼠多巴胺能神經元的死亡［8］。Salehi等［4］運用免疫印跡方法檢測PD和正常人腦脊液及血液中的HGF，發現2組血液中HGF濃度無明顯差異，而PD患者腦脊液中HGF的濃度遠高于正常人群，表明HGF參與了PD的病理生理過程。

外源性HGF蛋白在體內半衰期短，不易通過血腦屏障。構建含HGF基因的腺病毒載體可直接用于感染靶細胞，轉染宿主細胞后，外源基因至少持續表達2周，同時不整合入宿主細胞。因此，Ad-HGF與hUC-MSC結合將是修復PD的一種新型方法。本研究中，我們將Ad-HGF轉移到hMUMSCs中，重點觀察hMU-MSCs向多巴胺能樣細胞分化的情況。結果表明，hMU-MSCs感染Ad-HGF后逐步表達TH和DAT。同時還發現，hMU-MSCs的形狀在慢慢改變，從長梭形向多角形，而且還有一些長的突起，類似于對神經干細胞的形態，提示hUC-MSC在HGF的作用下具有向多巴胺能樣神經元分化的能力，為HGF基因修飾hUC-MSC治療帕金森病提供一定的細胞基礎。

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