七氟烷對糖尿病相關認知功能下降老年大鼠海馬谷氨酸和γ－氨基丁酸的影響

鄭曉春，吳桂壽，2，涂文劭，胡 彬，沈石文

2.三明市第二醫院 麻醉科，永安 366000；

3.福建醫科大學 醫學技術和工程學院，福州 350004

糖尿病（diabetes mellitus，DM）可引起體內復雜的代謝機制紊亂，其中樞神經系統的慢性、進展性并發癥對認知功能產生影響[1]，被稱為DM相關認知 降 低 （diabetes－associated cognitive decline，DACD），表現為空間執行功能、學習和記憶能力受損[2－3]，DM 患者發生 DACD的風險是正常人的1.5倍以上[4]。吸入麻醉劑七氟烷可導致一定程度的術后認知功能障礙[5－6]。本研究觀察七氟烷對DACD老年大鼠認知功能的影響和海馬神經遞質谷氨酸（glutamic acid，Glu）和γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）含量的改變，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康SD大鼠63只，月齡20月，體質量300～400g[福建醫科大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（閩）2012－0002]，雌雄不限。室溫（22±2）℃，濕度50%，明暗各12h，適應性飼養3d。通過Morris水迷宮訓練并達到“學會標準”（連續20次測試中≥18次正確）[7]。

分組：隨機分3組（n＝21）：（1）空白對照組（C組）：普通飼料喂養并排除 DM；（2）DACD 組（D組）：DM＋認知功能下降組；（3）DACD＋七氟烷組（DS組）：在D組的基礎上吸入3%七氟烷，余2組吸入100%氧，時長分別為1，2，3h（n＝7）。

1.2 試劑與儀器 七氟烷（250mL，美國Baxter公司），由蒸發器設定輸出濃度，載體為O2（100%）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司），用0.1mol／L 的 檸 檬 酸 緩 沖 液 配 成1%，以25mg／kg腹腔注射。七氟烷揮發罐（美國Abbott公司）；麻醉機（美國Ohmeda公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國安捷倫公司）；Morris水迷宮（中國晟昌公司）；精密電子分析天平（BP21ID，美國Sartorius公司）；多功能監護儀（MP60，荷蘭Philips公司）；有機玻璃方倉（0.4m×0.4m×0.6m，自制）。

1.3 方法

1.3.1 DM 模型的制備和鑒定 參照文獻[8]，大鼠高糖高脂飼料（10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%普通鼠飼料）喂養至第4周末，禁食12h，腹腔緩慢注射1%STZ，第3d測空腹血糖，如＞16.7mmol／L則認定為模型建立。

1.3.2 水迷宮測試評估學習和記憶能力 參照文獻[3]，DM老年大鼠飼料不變，繼續飼養至第16周末。Morris水迷宮水池直徑1.8m，水深0.35m，水溫（24±2）℃。水下平臺直徑0.1m，高0.3m，水中加入脫脂奶粉使之不可見。攝像機記錄動物位置、運行速度和運動軌跡。實驗第1～4d為定位航行試驗（學習功能），每天將大鼠分別從4個象限面向池壁置入水中3次，記錄入水至找到站臺的時間為逃避潛伏期。第1d為游泳訓練，若2min內未找到站臺，則將大鼠引導至站臺，逃避潛伏期記為2min，檢測完成后取第2～4d逃避潛伏期的平均值。第5d為空間探索實驗（記憶功能），去除站臺，所有大鼠從固定位置面向池壁置入水中，記錄其在2min內在各象限內的游泳時間，計算在站臺所在象限游泳時間占4個象限游泳時間的百分比（Tp／T）。全部實驗結束后第6d復查Morris水迷宮，觀察實驗后的記憶能力改變。

1.3.3 七氟烷吸入 麻醉機氣體流量計控制氧氣流量3L／min，七氟烷蒸發罐控制輸出濃度3%，多功能監護儀監測方倉內七氟烷濃度和大鼠脈搏氧飽和度（SpO2），若SpO2＜97%立即移出方倉脫離麻醉劑吸氧，SpO2＞99%再重新開始實驗。

1.3.4 海馬Glu及GABA含量測定 參照文獻[9－11]，大鼠處死后快速斷頭剝離海馬，電子天平稱質量（精確到0.1mg），加入2mL甲醇勻漿后取1mL離心，1 500r／min×5min。取上清100μL，加入衍生化試劑100μL，震蕩混勻反應2min后，取100μL測定Glu和GABA含量。衍生化試劑：20.01mg鄰苯二甲醛，超聲溶于500μL甲醇，加入500μLβ－巰基乙醇和9mL硼砂緩沖液（pH＝10.0）。色譜柱：Eclipse XDB C18（4.6mm×150mm，5μm）。流動相：A 液為 0.1mol／L Na2HPO4·12H2O－NaH2PO4·2H2O 緩 沖 液（pH＝6.8）；B液為甲醇；A液／B液＝6∶4。檢測波長：激發光波長345nm，發射光波長455nm，流速1mL／min，柱溫25℃，進樣5μL。將各氨基酸同內標的峰面積比值和各自濃度作標準曲線，測定含內標樣品的待測氨基酸與內標峰面積比值，求出樣品中2種氨基酸濃度。

Glu和 GABA含量（μg／g）＝[樣品濃度（μg／mL）×樣品溶解體積（mL）]／樣品重量（g）

2 結 果

2.1 空腹血糖的變化 3組血糖基礎值（0周）無差異，C組正常飼養16周內空腹血糖均正常，排除DM。D組、DS組高糖高脂飼養4周后體型肥碩，與C組比較，血糖增高，差別有統計學意義（均為P＜0.05）；注射STZ后至16周均出現拒食、體型瘦弱，與4周時比較，血糖均顯著增高，差別有統計學意義（P＜0.01），D組和DS組間差別無統計學意義（表1）。

表1 3組大鼠16周內空腹血糖的比較Tab 1 Fasting blood glucose mmol／L

2.2 水迷宮學習記憶能力 D組、DS組均出現逃避潛伏期延長、Tp／T百分比降低，與C組比較，差別均有統計學意義（P＜0.05），提示學習和記憶能力均下降。DS組吸入七氟烷后逃避潛伏期延長、Tp／T百分比下降更明顯，與C、D組比較，差別均有統計學意義（P＜0.05）；吸入3h改變幅度加劇，與吸入1，2h比較，差別均有統計學意義（P＜0.05），提示七氟烷對DACD老年大鼠的認知能力進一步降低，且和時間相關（表2）。

2.3 海馬Glu和GABA含量 D組和DS組Glu含量下降，GABA含量上升，Glu／GABA比值降低，與C組比較，差別均有統計學意義（P＜0.05）；隨著氣體吸入時間的增加，DS組的Glu含量明顯下降，GABA含量明顯上升，Glu／GABA比值明顯降低，與D組比較，差別均有統計學意義（P＜0.05），吸入3h后的比值僅為1h時的1／2，組內比較差別有統計學意義（P＜0.01，表3）。

3 討 論

近年來研究發現，STZ誘導后DM大鼠的學習能力明顯減退，持續高血糖可以導致認知功能障礙[12]，證實了在STZ誘導的DM大鼠模型上這是一個危險因素。研究發現，DM至少存在某些方面的認知功能障礙，特別是空間執行功能、學習、記憶能力受損[2－3]。本研究以高糖高脂飼養聯合STZ建立了DM模型。Morris水迷宮實驗是研究動物空間學習和記憶功能的經典方法，其中逃避潛伏期可客觀反應大鼠的學習能力，而Tp／T可反映大鼠的記憶能力。DACD大鼠逃避潛伏期明顯延長，Tp／T百分比明顯降低[13]。本實驗通過水迷宮測試篩選出DACD老年大鼠模型。

表2 大鼠逃避潛伏期和Tp／T的比較Tab 2 Escape latency and raito of Tp／T

表3 3組大鼠海馬Glu、GABA含量及Glu／GABA比值的比較Tab 3 The contents of Glu and GABA and the raito of Glu／GABA in hippocampus

七氟烷是目前臨床常用的吸入麻醉劑，3%的七氟烷反復吸入可導致老年大鼠一過性的認知功能障礙[5－6]。DACD老年人麻醉前已有認知功能降低，但不同的七氟烷吸入濃度和吸入時間對其記憶能力及中樞神經遞質的影響尚不明確。有研究測定大鼠七氟烷的肺泡最低有效濃度（mininal alveolar concentration，MAC）為2.4%[14]，其ED99是1.3MAC，即3.12%。因此本研究中選取七氟烷的濃度為3%，以吸入1，2和3h模擬臨床中不同的麻醉時長。

海馬作為中樞神經系統中邊緣系統的一部分，和學習、記憶以及空間定位功能密切相關，是影響記憶形成的重要部位，神經元、神經膠質細胞及其縫隙連接都參與其中[15]。Glu和GABA作為中樞神經系統具有代表性的一對興奮性和抑制性神經遞質，也分布于海馬記憶形成的通路上，影響著記憶的形成。研究表明，學習記憶功能與長時程增強作用（long－term potentiation，LTP）有關，其主要依賴于NMDA受體[7]。Glu與NMDA受體結合時，可開放Ca2＋通道或Na＋通道，形成興奮性突觸后電位，出現長時程增強，從而提高學習記憶功能；同時，GABA可致C1—內流，抑制長時程增強的形成，從而降低學習記憶功能。因此，興奮性Glu水平降低、抑制性GABA水平升高、Glu／GABA比值降低會導致學習記憶功能降低。本研究中DACD大鼠Glu、GABA與空白對照組差異不大，但七氟烷組Glu下降明顯，GABA顯著上升，Glu／GABA比值下降，其中吸入3h后變化更大，Morris水迷宮測試也證實了其記憶能力下降，提示七氟烷影響海馬突觸中興奮性－抑制性神經遞質的平衡，進一步抑制DACD老年大鼠的認知功能。Irifune等也認為，麻醉藥物主要是通過興奮或抑制中樞神經系統不同位點的突觸通路而產生效應，對突觸傳遞的抑制是全身麻醉的共同特性，直接或間接受體功能的抑制已被推測為麻醉作用的最后共同通路[16]。

綜上所述，長時間1.3MAC七氟烷吸入麻醉可進一步降低DM相關認知下降大鼠的記憶能力，其機制可能與七氟烷改變Glu和GABA平衡有關。

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