補陽還五湯對腦缺血大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響研究*

吳 旋汪 欣陳云歡蔡梅玉程 穎

補陽還五湯對腦缺血大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響研究*

吳 旋①汪 欣①陳云歡①蔡梅玉①程 穎①

目的：探討補陽還五湯對MCAO（大腦中動脈線栓法）大鼠血清TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響。方法：60只大鼠隨機分為四組：假手術組、模型組、補陽還五湯低劑量組、補陽還五湯高劑量組。Garcia JH評分標準評價受試大鼠的神經功能，化學發光法檢測大鼠外周血清TNF-a、IL-6的水平，免疫比濁法檢測大鼠血清CRP水平。結果：術后第7天，補陽還五湯低劑量組和高劑量組大鼠神經功能得到一定程度的恢復，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），同時低劑量組和高劑量組比較差異也有統計學意義（P＜0.05）。補陽還五湯低劑量組、高劑量組的TNF-a與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；高劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：補陽還五湯可下調MCAO大鼠TNF-a、IL-6、CRP水平，通過減輕炎癥作用，達到神經保護的作用。

補陽還五湯； 神經功能； 炎癥因子

腦缺血是臨床上心腦血管的多發病，具有較高的致殘率和致死率，如何在發病早期予以早期干預是目前臨床面臨的一個重要難題。補陽還五湯出自清代王清任《醫林改錯》，是臨床上治療腦缺血的重要方劑，然而其作用機制仍不明確。為深入探討其機制，本實驗采用大腦中動脈線栓法（MCAO）建立大鼠腦缺血模型，采用補陽還五湯進行灌胃治療，觀察補陽還五湯對MCAO大鼠外周血炎癥指標TNF-ɑ、IL-6、CRP的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級成年Wistar大鼠60只，雄性，100～150 g，購自福建中醫藥大學動物實驗中心。大鼠在實驗動物中心適應性喂養1周，待體重達到250～300 g開始進行干預、造模等工作。60只大鼠隨機分成四組：（1）假手術組：15只，假手術后，常規飼養于籠內，不進行任何干預治療；（2）模型組：15只，造模后常規飼養于籠內，不進行任何干預治療；（3）補陽還五湯低劑量組：15只，5 g/（kg·只）（按體表面積算相當于成人等效劑量），1次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續灌胃7 d。（4）補陽還五湯高劑量組：15只，25 g/（kg·只）（按體表面積算相當于成人等效劑量的5倍），1次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續灌胃7 d。

1.2 補陽還五湯制備 補陽還五湯各單味藥購自北京康仁堂藥業有限公司，嚴遵照原方配比而成，含生黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g。中藥飲片的質量標準參照《中國藥典》2010年版。按2006年7版《中藥藥理研究學》制備補陽還五湯水煎液，由福建中醫藥大學附屬康復醫醫院藥劑科完成：加水500 mL浸泡30 min，武火煎煮沸騰后改用文火加熱30 min收取1次藥液，再加水500 mL煎煮，方法同前，去藥渣后用濾紙過濾，將2液混合加熱濃縮，使生物藥濃度為1.2 g/mL，置于4 ℃下冷藏備用。

1.3 動物模型制備 術前禁食12 h，用3.4％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，參照文獻[1]，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型：頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離右側胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌之間的肌間隙，掀起右側胸骨舌骨肌的外側緣，即可見內下方的頸總動脈（CCA）與迷走神經。快速游離CCA，在距頸動脈分叉約5 mm處近心端結扎，并在結扎處和頸動脈分叉之間備一根縫合線，打單結，輕輕牽拉此縫合線以暴露周圍血管神經，邊分離CCA，邊牽拉縫合線向上滑行，直至CCA、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）和枕動脈與周圍組織游離。緊靠頸動脈分又處結扎ECA和枕動脈，在ICA穿線打活結暫時阻斷ICA血流。在CCA結扎處和其上端備線處之間剪一小口，用制備好的栓線沿CCA插入ICA，此時適度扎緊CCA備用的縫合線，以阻斷ICA血液流出為宜，同時松開ICA的結扎線，繼續沿ICA推進栓線，當感到有阻力時，停止進線，此時栓線即到達大腦中動脈起始處，扎緊CCA的縫合線，以防止其內的線栓移動和出血。最后剪除多余的栓線，分層縫合切口。注意避免損傷迷走神經。在插線的過程中要注意手感，當遇到阻力時，不要用蠻勁插入，手法要輕柔、迅速，按照動物的體重和營養選擇適當的栓線。術后2 h對大鼠進行神經行為學評價。以Longa 5級4分法評價模型的有效型。術后2 h和術后7 d分別采用Garcia JH評分標準評價受試大鼠運神經功能。

1.4 大鼠外周血TNF-a、IL-6、CRP檢測 造模后7 d處死大鼠，從腹主動脈采集動脈血5 mL，3500轉離心30 min后取血清，-20 ℃保存備用。采用化學發光法檢測血清TNF-a、IL-6，采用免疫比濁法檢測血清CRP。檢測儀器：西門子DPC Immulite全自動化學發光免疫分析儀和日立7180全自動生化分析儀，儀器當天相關質控在控。

1.5 統計學處理 應用SPSS 15.0統計學軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，比較采用兩樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補陽還五湯對MCAO大鼠神經功能的影響 術后第7天，補陽還五湯低劑量組和高劑量組大鼠神經功能得到一定程度的恢復，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；同時低劑量組和高劑量組比較差異也有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 補陽還五湯對大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的檢測結果 實驗結果顯示低劑量組、高劑量組的TNF-a與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；高劑量組的IL-6、CRP與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 補陽還五湯對大鼠神經功能評分的影響（±s） 分

表1 補陽還五湯對大鼠神經功能評分的影響（±s） 分

*與假手術組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05；#與低劑量組比較，P＜0.05

組別術后2 h術后7 d假手術組（n=15）18.0±0.018.0±0.0模型組（n=15） 7.8±0.8*8.4±1.0*低劑量組（n=15） 8.4±0.6 10.8±1.1△高劑量組（n=15） 9.0±0.9 12.5±1.3△#

表2 補陽還五湯對大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的影響（±s）

表2 補陽還五湯對大鼠血清TNF-a、IL-6、CRP的影響（±s）

*與模型組組比較，P＜0.05

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3 討論

補陽還五湯出自清代王清任著《醫林改錯》一書，由黃芪、赤芍、川芎、當歸、地龍、桃仁、紅花七藥組成，針對氣虛血瘀型中風后遺癥而設[2]。方中重用黃芪，少佐活血化瘀之品，諸藥合用，使氣旺血行、瘀祛絡通[3]。現代醫學研究證實，補陽還五湯具有擴張血管、增加腦血流量、改善微循環、降低血液黏滯性、抗血小板聚集、抗血栓、對抗腦缺血后腦組織損傷等多種途徑發揮臨床作用[4-6]。

本實驗結果顯示，MCAO大鼠經補陽還五湯灌胃治療后，神經損傷得到一定程度的恢復（P＜0.05），并且與藥物劑量密切相關（P＜0.05）。腫瘤壞死因子TNF-a，主要由單核巨噬細胞、T淋巴細胞及脂肪細胞等分泌，是體內重要的炎癥因子，具有多重生物功能，其對血管炎性反應過程的具有調節和促進生長的作用[7-8]。IL-6是白細胞和內皮細胞激活的關鍵，其在動脈粥樣硬化血管壁中的濃度為其血清濃度的200倍，同時其可使血管平滑肌增生，促進動脈硬化進展及斑塊由穩定向不穩定發展[9-10]，另外IL-6激活的白細胞可誘導大量細胞黏附，導致微血管堵塞，加重腦損傷，并與腦卒中后功能康復及腦梗死體積密切相關[11-12]。CRP是機體應激狀態時合成的急性期反應蛋白，在機體對炎癥、組織損傷、感染等反應中起著重要作用。CRP不僅是心血管病的獨立危險因子，而且可精確、敏感地反映粥樣硬化斑塊炎癥反應程度，與患者腦梗死面積大小及意識障礙水平相關[13-15]。

本實驗中MCAO大鼠術后第7天，采集大鼠外周血，觀察MCAO大鼠外周血相關炎癥指標TNF-a、 IL-6、CRP。結果顯示補陽還五湯（無論低劑量或高劑量）干預后，TNF-a均出現不同程度下降（P＜0.05），IL-6、CRP在高劑量組下降明顯，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示補陽還五湯可下調MCAO大鼠TNF-a、IL-6、CRP水平，通過減輕炎癥作用，達到神經保護的作用，從實驗室的角度進一步證實了補陽還五湯的功效。然而作為一個經方，補陽還五湯的作用還未十分明了，其中對細胞凋亡的調控將是未來本課題組研究的重要方向。

致謝：實驗平臺，福建省康復技術工程研究中心。

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Influence of Buyanghuanwu Decoction on the Expression of TNF-ɑ，IL-6，CRP in Cerebral Ischemia Rats/

WU Xuan， WANG Xin，CHEN Yun-huan，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（12）：030-032

Objective：To discuss the influence of Buyanghuanwu decoction on the expression of TNF-ɑ，IL-6，CRP in MCAO rats.Method：60 rats were divided into four groups：control group， model group，low-dose of Buyanghuanwu decoction group and high-dose of Buyanghuanwu decoction group.Motor nerve function of rat was evaluated by using Garcia JH score ，serum TNF-ɑ，IL-6 were detected by using bioluminescence and serum CRP were detected by using immunoturbidimetry.Result：7 days after surgery，compared with model group， nerve function of rats recovered in low-dose group and high-dose group，with significant difference（P＜0.05）.There was significant difference betweenlow-dose group and high-dose group（P＜0.05）.Compared with model group，there was significant difference of TNF-ɑ in low-dose group and high-dose group（P＜0.05）.Compared with model group，there was no difference of IL-6，CRP in low-dose group（P＞0.05） ，with significant difference in high-dose group（P＜0.05） .Conclusion：In order to protect nerve function，Buyanghuanwu decoction can reduce TNF-ɑ，IL-6，CRP and relieve inflammation.

Buyanghuanwu decoction； Nerve function； Inflammation factor

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.12.009

2014-10-27） （本文編輯：蔡元元）

福建中醫藥大學重點學科（腦血管疾病康復的基礎和臨床研究）專項校管課題（X2014076-學科）；福建省中青年教師教育科研項目（科技B類）（JB14056）；福建省衛生計生委青年科研課題（2014-2-37）

①福建中醫藥大學附屬康復醫院 福建 福州 350003

汪欣

First-author’s address：Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China