喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清酶的影響

王海潮 張興桃 董 增 吳 蕭（.宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000；2.宿州學院特色種植業(yè)苗種生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，安徽 宿州 234000）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）屬甲殼綱、十足目、方蟹科，又稱河蟹，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是一種經(jīng)濟蟹類，是中國傳統(tǒng)的名貴水產(chǎn)品之一［1］。近年來，河蟹日益嚴重的病害問題已成為養(yǎng)蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要阻礙因素之一。在蟹類疾病防治中，抗菌藥物發(fā)揮著重要作用，但由于病原微生物的耐藥性和機體藥物殘留等問題，部分藥物使用已受到了嚴格的限制。因此，研究抗菌藥物對機體的免疫影響來指導用藥就具有十分重要的意義。

喹諾酮類（quinolones）藥物具有廣譜、高效、低殘留、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，是常用的臨床抗菌藥物，也是魚病防治上公認的理想抗菌藥物［2－4］，目前水產(chǎn)上常用的喹諾酮類藥物主要有諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星等。范紅結(jié)等［5］報道恩諾沙星對中華絨螯蟹的雷氏普羅威登菌（Providenciarettgeri）敏感度很高；張雅斌等［6］用恩諾沙星對細菌性敗血病等5種諾酮類藥物幾乎對水生動物所有病原菌表現(xiàn)出較強的抗菌作用。喹諾酮類藥物對淡水養(yǎng)殖魚類常見病的病原菌均有較強的抑菌作用；但大量試驗［7－10］證明喹諾酮類藥物可引發(fā)消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)肝腎功能等臟器損害及過敏等不良反應。近年來，為系統(tǒng)評價甲殼動物的免疫水平，研究人員［11－14］先后采用了各種血清酶指標，其中應用較多的有酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶 （LSZ）等。研究［15－17］表明喹諾酮類藥物可影響動物免疫力，在低劑量時還對機體免疫系統(tǒng)有促進作用，增強機體免疫功能，增進機體對病原體的吞噬力；鞏華等［18］通過投喂恩諾沙星對鯉魚血清酶的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度藥物（1g/kg）對鯉魚肝、腎有明顯影響。關(guān)于抗生素對免疫的影響，除產(chǎn)生免疫抑制外，近年來對部分抗生素的免疫促進作用有較多報道［19］。張麗敏等［20］報道恩諾沙星以20mg/kg腹腔注射紅笛鯛，可明顯提高紅笛鯛血清中抗體IgM的含量，這種作用可持續(xù)3周左右，表明恩諾沙星對魚類體液免疫有良好的促進作用。王海潮等［21］研究過常用抗菌藥物對鋸緣青蟹體外血清酚氧化酶的影響，但喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹的體內(nèi)血清酶的免疫影響未見相關(guān)報道。本研究擬以中華絨螯蟹為試驗對象，研究3種喹諾酮類藥物諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星對中華絨螯蟹血清酚氧化酶（PO）、過氧化物酶（POD）、堿性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等活力指標的影響，旨在為中華絨螯蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)中合理用藥提供科學依據(jù)，并為進一步研究漁用藥物的作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

中華絨螯蟹：體質(zhì)量為（150±30）g，安徽宿州某養(yǎng)殖場提供。選擇體色好、步足健全、無外傷的個體，隨機分成4組，每組18只，暫養(yǎng)于48cm×37cm×29cm塑料箱中，試驗期間水溫（23±2）℃，鹽度19.5‰。

1.2 儀器與試劑

酶標儀：VersaMax型，美國 Molecular Devices Corporation（MDC）公司；

可見分光光度計：751型，上海分析儀器廠；

3，4－二 羥 苯 丙 氨 酸 （L－3，4－dihydroxyp henylalamine，L－DOPA）：分析純，美國Sigma公司；

溶壁微球菌AS1.635（Micrococcus lysoleikticusAS1.635）凍干粉：生物試劑，中國科學院微生物研究所菌種保藏中心；

抗菌藥諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星：針劑，質(zhì)量分數(shù)均為99%，東北制藥廠（GMP獸藥認證公司）；

SOD、AST和ALT測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

其余試劑：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗菌藥物的注射 取注射用無菌諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星針劑，用無菌生理鹽水稀釋到3.75mg/mL。酒精棉球消毒中華絨螯蟹步足基部后，注射約0.2mL藥液，使中華絨螯蟹注射量為5mg/kg體質(zhì)量（為常規(guī)疾病治療劑量）。每組注射18只中華絨螯蟹，對照組注射無菌生理鹽水。

1.3.2 血清的制備 注射藥液組分別于注射后6，12，24，48，72，96h隨機取6只中華絨螯蟹，抽取血淋巴（在第四步足與背面交界處），在4℃下以8 000r/min離心5min，吸取上清液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酚氧化酶（PO）活力的測定 根據(jù)文獻［22］修改如下：在96孔酶標板中進行反應，反應孔中加入0.2mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（PB）170μL，10μL注射抗菌藥物的待測中華絨螯蟹血清，充分混合后37℃保溫15min，再加入0.6mg/mL L－DOPA 20μL，立即放入 MD VersaMax酶標儀中，振蕩混勻后，每隔5min讀取490nm處吸光值，反應15min；以每分鐘OD490增加0.001作為1個酶活力單位（U）。對照組用生理鹽水。

在江漢油田涪陵頁巖氣公司，有個爆紅的“小米現(xiàn)象”—頁巖氣公司技術(shù)中心的技術(shù)員們來的最早、走的最晚，辦公樓幾乎夜夜燈火通明。而這個現(xiàn)象起源于技術(shù)員米瑛……

1.3.4 過氧化物酶（POD）活力的測定 根據(jù)文獻［23］修改如下：以鄰苯二胺為底物，在96孔酶標板中加入20μL血清，再加入180μL顯色緩沖液（C6H8O7·H2O 7.3g，Na2HPO4·2H2O 11.86g，雙蒸水定容至1 000mL），置于酶標儀中，測490nm處的OD值（A3）；向樣品中加入鄰苯二胺4mg，30%H2O24μL，10mL顯色緩沖液配置的顯色液20μL，待搖勻后，顯色15min，測490nm處的OD值（A4）。POD相對活力以APOD＝A4－A3表示。

1.3.5 堿性磷酸酶（ALP）活力的測定 根據(jù)文獻［24］修改如下：取血清200μL，加入800μL pH 8.8的Tris—HCl緩沖液（加入Tris堿121.1g，濃鹽酸70mL，用雙蒸水定容到1 000mL），于37℃水浴10min，然后加入5mmol/L的底物50μL，反應10min，加入0.1mol/L NaOH 溶液4mL終止反應，生成的對硝基酚在400nm處測定。空白是將血清換為雙蒸水。以每分鐘吸光值上升0.01為一個活力單位。

1.3.6 血清溶菌酶（LSZ）活力的測定 根據(jù)文獻［25］修改如下：以溶壁微球菌凍干粉為底物，溶于0.1mol/L pH 6.4的磷酸鉀鹽緩沖液中，調(diào)整菌懸液的OD值（OD570＝0.3），在冰浴中加入3mL菌懸液于小試管內(nèi)，再加入50μL待測血清，混勻，立即在570nm下測其OD值，后將試管移入37℃水浴中反應30min，取出，迅速在冰浴中終止反應，測其OD值。溶菌活力按式（1）計算：

式中：

U——血清溶菌酶（LSZ）活力，U；

A1——待測血清反應前的OD值；

A2——待測血清反應后的OD值。

1.3.7 其他酶指標的活力測定 血清超氧化物岐化酶（SOD）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活力的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，按試劑盒操作說明書進行。上述測定均用751分光光度計進行讀數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2013軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，用SPSS（statiscal package for the social science）13.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，當差異顯著（P＜0.05）時，用LSD檢驗法進行均值間多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹諾酮類對酚氧化酶（PO）活力的影響

注射諾氟沙星等3種喹諾酮類抗菌藥后，中華絨螯蟹體內(nèi)PO活力在短期內(nèi)出現(xiàn)上升，在6～12h達到最大值，此后逐漸減小；注射生理鹽水的對照組PO活力基本穩(wěn)定，后期酶活力略有下降；恩諾沙星對PO的活力增高最為明顯，6h時的PO活力較對照組升高73.44%，差異極顯著（P＜0.01）；96h后，PO活力下降至與對照組基本相同。上述結(jié)果初步表明，3種藥物注射后可使中華絨螯蟹的PO活力得到提高，其中以恩諾沙星的影響最為明顯（圖1）。王海潮等［16］研究喹諾酮類抗菌藥物對鋸緣青蟹PO的體外試驗表明，低濃度時表現(xiàn)為增強作用，與本試驗結(jié)果一致。

圖1 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清PO活力的影響Figure 1 Effects of quinolones on the PO activity of serum of Eriocheir sinensis

2.2 喹諾酮類對過氧化物酶（POD）活力的影響

由圖2可知，中華絨螯蟹體內(nèi)POD活力在短期內(nèi)出現(xiàn)上升，在6～12h達到最大值，此后逐漸減小；注射鹽水的對照組POD活力基本穩(wěn)定，后期酶活力略有下降；POD活力在6～12h時達最大值，諾氟沙星、氧氟沙星和恩諾沙星組的POD活力分別比對照組升高34.53%，26.62%，39.18%，差異顯著（P＜0.05）；96h后，POD活力下降至與對照組基本相同。3種藥物注射后可使中華絨螯蟹POD活力得到提高，其中以恩諾沙星的影響最為明顯。過氧化物酶是一類含輔基鐵卟啉的酶類，主要作用為清除細胞生理代謝過程中的活性氧，減少其對正常細胞的損傷，提高機體的解毒免疫功能和防病抗病能力［14］，是機體解毒免疫功能和防病抗病能力的重要指標之一。本試驗POD活力增加，表明喹諾酮類藥物可以增強機體的免疫功能和抗病能力。

圖2 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清POD活力的影響Figure 2 Effects of quinolones on the POD activity of serum of Eriocheir sinensis

2.3 喹諾酮類對堿性磷酸酶（ALP）的影響

中華絨螯蟹注射藥物后，短期內(nèi)ALP活力有明顯升高，ALP活力在48h升至較高水平，與對照組有顯著差異（P＜0.05）；隨后逐漸降低，至96h時注射不同藥物組ALP降至與對照相同水平，對照組酶活力未出現(xiàn)相應變化。結(jié)果表明：中華絨螯蟹注射藥物后ALP活力升高，3種抗菌藥物對中華絨螯蟹ALP的影響程度為恩諾沙星＞諾氟沙星＞氧氟沙星（圖3）。堿性磷酸酶可修飾改變細菌表面結(jié)構(gòu)使其更易為機體識別，加快免疫系統(tǒng)對異物的識別、吞噬和清除，為免疫的常規(guī)指標酶類之一。ALP活力明顯升高，表明免疫系統(tǒng)對異物識別的結(jié)果。

圖3 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清ALP活力的影響Figure 3 Effects of quinolones on the ALP activity of serum of Eriocheir sinensis

2.4 喹諾酮類對溶菌（LSZ）活力的影響

注射后，可出現(xiàn)血清溶菌活力升高，溶菌活力在24h時升至最大值，比對照組溶菌酶活力提高44.27%～79.56%，呈顯著差異（P＜0.05），隨后下降，96h降至與對照組相同水平，對照組整個試驗期間溶菌水平無明顯變化（圖4）。表明注射藥物可使中華絨螯蟹血清溶菌水平提高，以恩諾沙星最為明顯，其次依次為諾氟沙星和氧氟沙星。溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，在機體防御中起重要的作用［26］，是甲殼動物重要的體液非特異性免疫因子。多種免疫增強劑可增強甲殼動物溶菌酶活力，提高機體抗病能力［14］。本試驗注射喹諾酮類藥物后，出現(xiàn)血清溶菌活力升高，證實可以提高機體抗病能力。

2.5 喹諾酮類對超氧化物歧化酶（SOD）的影響

圖4 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清LSZ活力的影響Figure 4 Effects of quinolones on the LSZ activity of serum of Eriocheir sinensis

注射藥物后，短期內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活力有明顯升高，SOD活力在6～12h時升至較高水平，與對照組有顯著差異（P＜0.05）；隨后逐漸降低，至96h時注射不同藥物組的SOD降至與對照相同水平，對照組酶活力未出現(xiàn)相應變化。結(jié)果表明：中華絨螯蟹注射藥物后促進了SOD活力的升高，恩諾沙星對中華絨螯蟹的血清SOD的影響最顯著（圖5）。SOD活性與生物免疫水平密切相關(guān)，可作為機體非特異性免疫力的重要評判指標［27］。多糖、滅活菌體、殼聚多糖、中藥等通過注射和口服方式可顯著增強河蟹的SOD活力［28］，與本試驗注射藥物后SOD活力升高的結(jié)果一致。

圖5 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清SOD活力的影響Figure 5 Effects of quinolones on the SOD activity of serum of Eriocheir sinensis

2.6 喹諾酮類對中華絨螯蟹血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響

由圖6可知，注射藥物及生理鹽水12h內(nèi)，中華絨螯蟹血清AST活力均降低，24h后轉(zhuǎn)趨于平穩(wěn)。比較24～96h的轉(zhuǎn)氨酶水平差異，發(fā)現(xiàn)注射藥物各組的血清AST均低于對照組。血清轉(zhuǎn)氨酶水平主要用于評價臟器受損情況，存在于胞內(nèi)，是組織病變、中毒臟器大面積損傷的重要指標，潘魯青等［29，30］研究重金屬對凡納濱對蝦和鋸緣青蟹毒性時發(fā)現(xiàn)，Cu2＋、Zn2＋和Cd2＋經(jīng)24h作用，可使凡納濱對蝦和青蟹血清轉(zhuǎn)氨酶活力升高，而肝胰腺、鰓絲和肌的酶活力隨之降低，表明相關(guān)酶隨組織損傷逸出臟器。本試驗中血清AST均低于對照組，表明在常規(guī)使用劑量下，藥物未對中華絨螯蟹產(chǎn)生內(nèi)臟器官的明顯損傷。

圖6 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清AST活力的影響Figure 6 Effects of quinolones on the AST activity of serum of Eriocheir sinensis

2.7 喹諾酮類對谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的影響

由圖7可知，注射藥物及生理鹽水12h內(nèi)，中華絨螯蟹血清ALT降低趨勢明顯，24h后轉(zhuǎn)氨酶指標趨于平穩(wěn)。試驗期間注射藥物各組血清ALT均低于對照組。表明在常規(guī)使用劑量下，藥物未對中華絨螯蟹內(nèi)臟器官產(chǎn)生明顯的損傷。本試驗中藥物及生理鹽水注射組均出現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)氨酶指標急劇升高，隨后降低的現(xiàn)象，表明轉(zhuǎn)氨酶指標可隨注射刺激出現(xiàn)較大波動，可能與注射刺激有關(guān)。

圖7 喹諾酮類藥物對中華絨螯蟹血清ALT活力的影響Figure 7 Effects of quinolones on the ALT activity of serum of Eriocheir sinensis

3 結(jié)論

在5mg/kg肌肉注射后，中華絨螯蟹血清PO、LSZ、POD、ALP和SOD 6～24h均有不同程度的提高，但這種促進作用不能持久，在48～96h后基本回落至與對照相同水平。對照組相關(guān)酶指標在試驗過程中基本保持穩(wěn)定，這種短效免疫增強作用的產(chǎn)生機制以及對中華絨螯蟹健康的影響，有待于今后進一步研究。本試驗還發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星對中華絨螯蟹血清PO、LSZ、POD、ALP和SOD等酶的影響均較諾氟沙星和氧氟沙星顯著，可能與恩諾沙星代謝緩慢殘留在機體時間較長有關(guān)，相關(guān)機理正在進一步研究之中。

對青蟹酚氧化酶體外試驗結(jié)果表明，高濃度（500μg/mL）的喹諾酮類藥物對PO有明顯抑制作用，藥物濃度為5～10μg/mL時（常規(guī)使用劑量），對青蟹PO無明顯影響。本試驗是在體外試驗的基礎(chǔ)上，以正常給藥劑量（5mg/kg）用藥，未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，表明正常用藥對機體健康影響不大，低劑量給藥，還可以提高中華絨螯蟹的免疫機能。

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