中藥藥渣發酵生產毛云芝菌漆酶培養基的工藝研究

岳 鹍 潘志恒 孫勇民（天津現代職業技術學院，天津 300350）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是一類含銅多酚氧化酶，真菌漆酶因其來源廣泛、催化活性強而具有廣泛應用前景和價值［1，2］，但真菌漆酶通常為次級代謝酶，產酶周期長且產酶量低，嚴重限制了漆酶的工業化生產［3，4］。

中國是中藥資源消耗大國，中成藥生產、中藥飲片炮制、含中藥成分輕化工產品生產過程中均有大量藥渣產生。中藥藥渣種類多樣、濕度高、處理難度大，目前大部分均采用焚燒或填埋方式進行處理，既造成了中藥資源的浪費，又造成了水體、大氣的污染。由于中藥藥渣中含有較豐富的營養成分，如多糖、木質素、氨基酸及微量元素等，部分研究［5，6］表明一些中藥藥渣可顯著促進真菌生長及次級代謝酶的產生，目前僅有利用白芍藥藥渣固體發酵亮菌產漆酶的研究［7］，未見利用藥渣進行液體發酵的相關研究報道。本試驗擬以常見中藥藥渣為研究對象，篩選獲得合適中藥藥渣誘導漆酶產量提高的同時，發揮真菌生物降解作用，充分利用中藥渣的生物質資源，使其變廢為寶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

毛云芝菌（Coriolus hirsutus）：由安徽大學生命科學學院提供，4℃下保存于PDA斜面培養基中；

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、溶性淀粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏：生化試劑，天津市化學試劑一廠；

五水合硫酸銅、硫酸鎂、磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司；

2，2’－聯氮二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸鹽）（ABTS）：分析純，Aladdin Chemistry Co.Ltd。

1.1.2 主要儀器設備

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX－75KBS型，上海申安醫療器械廠；

恒溫培養振蕩器：ZWYR－2102C型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

紫外可見分光光度計：T6系列，北京普析通用儀器有限責任公司；

潔凈工作臺 ：HCB－1800H型，海爾集團；

電子天平：ME104E型，梅特勒—托利多國際貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基組成及培養條件

（1）液體種子培養基：馬鈴薯汁30%（m/V），葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然。

（2）搖瓶培養基：小麥麩皮3%（m/V），蛋白胨0.2%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自然。

（3）基礎培養條件：在250mL三角瓶中，裝液量50mL，接種量10mL，培養溫度30℃，轉速200r/min，振蕩培養12d［8］。

1.2.2 培養時間對毛云芝菌生長及產酶酶活的影響 采用搖瓶培養基，在接種量20%，培養溫度30℃，轉速200r/min的條件下對毛云芝菌進行培養，每24h取50mL發酵液，分析毛云芝菌生長及產酶酶活隨培養時間的變化情況。

1.2.3 中藥藥渣對產酶的影響 采用基礎培養條件，以搖瓶培養基為基礎，在搖瓶培養基中分別加入10%（m/V）防風、川芎、當歸、芍藥、大黃、麻黃、連翹及蒼術8種中藥渣，比較不同類型中藥藥渣對毛云芝菌生長及其產酶酶活的影響。

1.2.4 碳源對產酶的影響 采用基礎培養條件，以搖瓶培養基 為 基 礎，在 蛋 白 胨 0.2% （m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自然的條件下，分別以3%（m/V）的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉及麩皮為碳源，比較不同碳源對毛云芝菌生長及其產酶酶活的影響。

1.2.5 氮源對產酶的影響 采用基礎培養條件，以搖瓶培養基為基礎，在小麥麩皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然的條件下，分別以0.2%（m/V）的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、花生粉、黃豆粉和尿素為氮源，比較不同氮源對毛云芝菌生長及其產酶酶活的影響。

1.2.6 中藥藥渣添加量對產酶的影響 采用基礎培養條件，以搖瓶培養基為基礎，在搖瓶培養基中分別加入6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%（m/V）大黃藥渣，比較不同藥渣添加量對毛云芝菌生長及其產酶酶活的影響。

1.2.7 碳氮比對產酶的影響 采用基礎培養條件，以搖瓶培養基為基礎，在小麥麩皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自 然 的 條 件 下，分 別 加 入 0.16%，0.18%，0.20%，0.22%，0.24%，0.26%，0.28%（m/V）蛋白胨，考察不同C/N比對毛云芝菌生長及其產酶酶活的影響。

1.2.8 pH值對毛云芝菌產酶的影響 采用基礎培養條件，以搖瓶培養基為基礎，在蛋白胨0.2%（m/V），小麥麩皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L的條件下，分別在pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0下進行培養，比較不同pH值對毛云芝菌生長及其產酶酶活的影響。

1.2.9 理化分析方法

（1）菌絲干重的測定：采用干燥稱重法［9］。

（2）漆酶活力的測定：采用分光光度法［10］。

2 結果與分析

2.1 培養時間對毛云芝菌生長及產酶酶活的影響

由圖1可知，在初始無藥渣添加的搖瓶培養基中，1～3d時毛云芝菌處于調整期，此階段毛云芝菌產酶能力較弱；3～9d時毛云芝菌進入指數生長期，伴隨著毛云芝菌的快速生長，其產酶能力也迅速增強；9～12d時毛云芝菌生長逐步進入穩定期，此階段毛云芝菌產酶能力及酶活逐步達到峰值；培養12d后，毛云芝菌產酶能力隨著菌絲體進入衰亡期而逐步降低。因此，根據培養變化曲線確定菌種培養時間為12d。

圖1 培養時間對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 1 Effects of culture time on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2 毛云芝菌藥渣培養基的優化

2.2.1 中藥藥渣對產酶的影響 由圖2可知，8種中藥藥渣對毛云芝菌培養影響效果存在明顯差異。毛云芝菌漆酶是一種誘導酶，研究［11］表明，漆酶的合成與菌絲體的生長沒有明顯的相關性，在毛云芝菌生產過程中通常需要添加誘導劑促進漆酶的分泌。常見的誘導劑有小分子芳香化合物、木質素、糖苷類物質及酚類物質等［12］。試驗［13］表明，大黃藥渣中的土大黃甙、麻黃藥渣中的鼠李糖甙及芍藥藥渣中的芍藥甙均能有限促進漆酶的分泌；防風、連翹及蒼術藥渣中富含的色酮、內酯類物質對漆酶分泌影響不明顯；當歸、川芎藥渣對漆酶的分泌存在明顯的抑制作用，這可能是由于當歸、川芎藥渣中富含的藁本內酯、川芎釅內酯等揮發性油性成分具有明顯的抑制真菌活性作用造成的。綜合考慮，試驗選擇大黃藥渣作為添加中藥藥渣。

圖2 中藥藥渣對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 2 Effects of different medicine slag on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

圖3 碳源對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 3 Effects of different carbon sources on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.2 碳源對產酶的影響 由圖3可知，毛云芝菌利用天然碳源的能力較強，能夠生長的基質廣泛。從毛云芝菌菌絲體生長情況上看，可溶性淀粉、葡萄糖及蔗糖等作為碳源時，雖促進了毛云芝菌菌絲體生物量的提高，但產酶酶活卻很低，這表明毛云芝菌產酶與其菌絲體的生長沒有明顯的正相關性，選擇合適的誘導劑及其用量是漆酶優化工藝中非常重要的步驟。從產酶酶活上比較，麩皮作為碳源的效果明顯優于其他碳源，這可能是由于麩皮中富含的木質素類似物、維生素（尤其是B族維生素）均是毛云芝菌漆酶分泌的誘導劑，有效促進了毛云芝菌產酶能力的提高［14］。綜合考慮，選擇麩皮作為培養基中的碳源。

2.2.3 氮源對產酶的影響 由圖4可知，生長在不同氮源培養基上的毛云芝菌菌絲體具有一定差異，毛云芝菌對黃豆粉、蛋白胨及酵母膏的利用能力要優于尿素、牛肉膏和花生粉，這可能是因為蛋白胨、黃豆粉中的部分營養物質可作為碳源被利用，促進了營養平衡和物質轉化。

圖4 氮源對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 4 Effects of different nitrogen sources on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

但從產酶酶活上比較，蛋白胨、酵母膏及牛肉膏3種氮源的效果要優于其他3種氮源，這主要是由于花生粉、黃豆粉作為慢速氮源，使用時毛云芝菌前期生長速度受到了明顯的影響，菌體積累不足，抑制了漆酶的產生。因此，快速氮源——蛋白胨作為培養基的氮源更為合適。

2.2.4 中藥藥渣添加量對產酶的影響 由圖5可知，毛云芝菌生長受大黃藥渣添加量的影響不顯著；但產酶酶活受到大黃藥渣添加量的影響，呈現先增大后減小的趨勢，造成這種現象是大黃藥渣除了含有誘導漆酶分泌的糖苷類物質，同時還含有一定量的抑制真菌活性的有機酸（酯）類揮發油性成分，當大黃藥渣添加量不斷增大時，糖苷類物質的誘導作用逐步達到峰值，繼續增加藥渣添加量，其中揮發油性成分抑制真菌活性的作用逐漸顯現，漆酶產量又逐漸下降［15］。因此，綜合考慮產酶酶活和藥渣添加量，大黃藥渣的添加量選擇為12%。

圖5 藥渣添加量對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 5 Effects of different amount of medicine slag on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.5 碳氮比對產酶的影響 由圖6可知，培養基的C/N是毛云芝菌產酶的重要影響因素。漆酶作為一種代謝產物，一般在培養基中氮源物質耗盡時才開始分泌；當C/N較小時，毛云芝菌生長過于旺盛，培養基中氮源充足，抑制了漆酶的分泌；當C/N較大時，培養基中氮源不足，毛云芝菌生長不良，不利于漆酶的發酵生產；當C/N為20時，漆酶活力達到最高值。因此，本試驗C/N比選擇為20。

圖6 碳氮比對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 6 Effects of different C/N ratio on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.6 pH值對產酶的影響 由圖7可知，當底物的初始pH值為4.5時，漆酶活力達到最高；繼續升高初始pH值，漆酶活力也逐漸降低，這主要是由于當pH值小于4.0時，毛云芝菌生長困難，產酶能力也相應降低；pH值超過5.0也出現降低趨勢，其原因主要是酸性條件可以抑制細菌的生長，有益于真菌的生長，促進真菌漆酶的分泌?？紤]到底物在略偏酸條件下可以抑制細菌的污染，因此云芝菌液體發酵產酶的初始pH值以4.5～5.0為宜。

2.3 優化培養基與原培養基的比較試驗

將上述試驗優化所得的結果進行組合，初步得到的毛云芝菌藥渣培養基的組成為：碳源麩皮3%（m/V），氮源蛋白胨0.2%（m/V），大黃藥渣12%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 5.0。利用此培養基與初始搖瓶培養基，在相同培養條件下同時培養12d，比較添加藥渣前后毛云芝菌的生長及產酶酶活的差異。

由表1可知，添加了大黃藥渣的培養基與初始搖瓶培養基相比，毛云芝菌的生物生長量及產酶酶活均有顯著的提高，大黃藥渣對毛云芝菌發酵產漆酶存在明顯的促進作用。

圖7 pH值對毛云芝菌生物量及其產酶酶活的影響Figure 7 Effects of pH on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

表1 優化培養基與原培養基的酶活比較Table 1 Comparison of enzyme activity of laccase cultured in original and optimized medium

3 結論

本試驗開展了利用中藥藥渣促進毛云芝菌漆酶產酶效果的影響研究，通過比較多種常見中藥藥渣，發現大黃藥渣促進毛云芝菌產酶能力及產酶酶活的提高效果最為明顯。試驗結果表明，毛云芝菌在初步優化的大黃藥渣培養基中的產酶酶活較原培養基產酶酶活提高了1.4倍。

中藥藥渣是中藥提取生產過程中的廢棄物，處置不當易造成污染環境。然而，中藥藥渣尤其是根莖類中藥藥渣中含有大量的木質素、纖維素和功能性成分，具有較大的開發利用價值。目前，中藥藥渣用于固體發酵技術的研究相對較多，本試驗結果表明中藥藥渣用于液態發酵也同樣能取得較好的效果，為中藥藥渣的綜合應用探索了新途徑。

本試驗目前只初步對各種常見中藥藥渣進行了篩選，并針對大黃藥渣培養基進行了初步優化，后續還將對微量元素、維生素對毛云芝漆酶藥渣培養條件的影響進行深入的研究，以期獲得更高的產酶酶活。

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