新疆傳統馕發酵面團中酵母菌的多樣性分析

米爾班古麗·阿卜杜如蘇力，瑪依古麗·庫爾班，努斯熱提古麗·安外爾，艾合買提江·艾海提，吐爾遜阿依·麥麥提依明，艾科拜爾·木哈塔爾，木合塔爾·阿布都克里木，祖麗皮亞·玉努斯，艾爾肯·熱合曼

（新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046）

新疆傳統馕發酵面團中酵母菌的多樣性分析

米爾班古麗·阿卜杜如蘇力，瑪依古麗·庫爾班，努斯熱提古麗·安外爾，艾合買提江·艾海提，吐爾遜阿依·麥麥提依明，艾科拜爾·木哈塔爾，木合塔爾·阿布都克里木，祖麗皮亞·玉努斯*，艾爾肯·熱合曼*

（新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046）

采用平板分離與純化、26S rDNA D1/D2區域序列測定和系統發育分析方法，對新疆烏魯木齊、阿勒泰、伊犁、喀什、阿克蘇及和田6 個地區民間傳統馕面團發酵酵母菌多樣性進行了研究。從中分離得到227 株酵母菌，它們隸屬于10 個屬14 個種：Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces servazzii、Pichia fermentans、Pichia membranifacies、Pichia kudriavzevii、Pichia anomala、Candida humilis、Hanseniaspora uvarum、Torulaspora delbrueckii、Wickerhamomyces anomalus、Cladosporium ramotenellum、Cryptococcus albidus、Kodamaea ohmeri、Issatchenkia orientalis；其中Saccharomyces cerevisiae為優勢種，占總分離株的55.51%（126 株），在系統發育樹上形成2 個大分枝4 個小分枝，A1-1分枝由115 株菌株構成，是馕面團發酵的優勢品系菌群。研究結果闡明了新疆民間傳統馕面團中酵母菌的多樣性，為開發利用傳統馕面團的酵母菌資源提供了理論依據。

馕面團；酵母菌；26S rDNA D1/D2區域

馕是以面粉為主要原料，經發酵后放少許鹽，在特制的馕坑中烘烤而成的，大小、形狀、厚薄不一的圓形餅。馕作為一種干糧，在中國新疆、中亞、南亞、西亞、中東及東南歐地區廣泛地被烤制和食用，品種多達50多種，具有香、脆、酥等特點，已被人類食用了數千年[1-2]。

馕面團發酵是采用民間傳統面團發酵方法，在新疆廣大城鄉居民家庭中至今仍被廣泛應用，所謂馕面團是上次打馕留下來的發酵面團，一直在鄰居之間相互借用，受到空間距離與地理條件的限制，一般不容易產生遠距離的借用傳播現象。馕面團發酵的酵母菌在馕的烤制工藝中是一個非常重要的關鍵因素，發酵菌種的不同會直接影響到馕的風味、成色與質量。本研究中采集樣品的6 個地區都是相互之間有荒漠隔離區的綠洲，相互直線距離均遠于300 km，一個地區選取的2～3 個馕房的相互直線距離也不低于30 km，所以每個樣品的酵母菌的多樣性不會受到其他不同樣品的影響。

國外對傳統發酵劑酸面團的研究報道較多，Succi[3]、Luangsakul[4]、Vrancken[5]、Meroth[6]等對不同地區不同來源的酸面團和酵面中的微生物進行過研究，Huys等[7]對40 篇原始的有關酸面團的文章做了綜述，同時也將重復出現的菌株進行了報道，總結出S. cerevisiae、Candida humilis、Pchia kudriavzevii、Kazachstania exigua、Torulaspora delbrueckii、W. anomalus 6 個物種是酸面團中最常見的酵母類群。國內目前關于傳統發酵劑中酵母菌的研究較少。馬智剛等[8]研究了饅頭面團長時間發酵過程中的酵母菌、醋酸菌、乳酸菌、大腸桿菌等微生物的變化。李自紅[9]從民間采集的饅頭老酵頭中分離酵母菌25 株，篩選出制作饅頭的優良酵母菌被鑒定為釀酒酵母。吳斯日古冷[10]從28 份酸面團樣品中共分離出酵母菌85 株，其中S. cerevisiae占50.59%。潘向輝[11]從內蒙古采集的酸面團中分離篩選出5 株酵母菌并對其進行發酵特性研究。到目前為止，尚未見馕發酵面團酵母菌多樣性有關的報道。因此，本實驗以采自新疆烏魯木齊、阿勒泰、伊犁、阿克蘇、喀什及和田的馕面團為對象，以26S rDNA D1/D2區域的堿基序列分析為依據，對分離酵母菌株進行分子鑒定，了解馕面團中存在的酵母菌群落結構，對其分布概況和多樣性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自新疆維吾爾自治區烏魯木齊、阿勒泰、伊犁、阿克蘇、喀什與和田6 個地區，每地區選擇2～3 個相互隔離的馕房采集適量的馕面團，保存于滅菌的采樣管內，4 ℃條件下運回實驗室，保存備用。

乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic disodium salt，EDTA-2Na）、十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、Tris、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、瓊脂糖、Marker DL 15 000 bp 上海Sangon生物公司；DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Buffer、溴酚藍（DNA Loading Buffer）天根生化科技有限公司；引物NL1、NL4 北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR 儀 美國Bio-Rad公司；Alphaimage2200TM凝膠成像儀 美國Alphaimage公司；DYY-8C水平電泳槽北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與純化

菌株分離采用PDA（馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%）和YPD（葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%、瓊脂2%）培養基。采用梯度稀釋涂布平板法進行分離，稱取馕面團樣品10 g，溶解于90 mL含有玻璃珠的滅菌生理鹽水中，振蕩30 min，分別取10－1～10－55 個梯度濃度，每皿100 μL，涂布分離。28 ℃培養48～120 h，挑取不同形態單菌落，編號，經多次劃線純化，獲得純培養物[12]。

1.3.2 菌株基因組DNA的提取

菌株DNA的提取采用CTAB法[13-15]。

1.3.3 26S rDNA D1/D2區域PCR擴增和序列測定

用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）擴增所分離菌株的26S rDNA D1/D2區域[16]。PCR擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min，最后于4 ℃保存[17-18]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的目標產物[19]。所得產物送生工生物工程（上海）股份有限公司和北京鼎國昌盛生物技術有限公司進行測序。

1.3.4 序列分析及系統發育樹的構建

測序結果用Seqman軟件序列圖譜人工校對。校正后所測菌株的26S rDNA D1/D2區域序列在GenBank數據庫中進行同源序列搜索（BLAST search），比較供試菌株與已知酵母菌之間的親緣關系及其系統地位并將序列提交到GenBank核酸序列數據庫得到登錄號[20-21]。根據同源序列搜索結果，下載相關模式菌種的D1/D2區域序列，與供試菌的序列一起用Clustal X軟件進行序列校準排齊，用Mega 5.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining），進行1 000 次Bootstrap檢驗后構建系統發育樹[22-23]。

2 結果與分析

2.1 酵母菌鑒定結果

本研究從新疆6 個地區的馕面團樣品中共分離到酵母菌227 株，對其進行了形態學觀察及26S rDNA D1/D2區域序列分析。目前國際上公認的酵母菌分類標準一般認為，如果測試菌株的26S rDNA D1/D2區域序列與已知種的相似性為99%以上，并有形態特征的支持時，則對其作出種的鑒定；與最近緣的已知種的相似性為98%或以下時，則可初步確定為新種；相似性在98%～99%之間時，則需要結合ITS序列分析和生理生化特征比較對其作出分類學處理[24-26]。通過BLAST search發現，分離菌株26S rDNA D1/D2區域序列在500～630 bp，符合酵母菌26S rDNA D1/D2區域理論預期值（約為600 bp）。分離到的227 株菌（表1）序列比對與相應的模式菌株同源性均為99%～100%，未發現潛在新種。這227 株酵母菌隸屬于10 個屬，分別為釀酒酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、Wickerhamomyces屬、Kodamaea屬和Cladosporium屬，共有14 個種，其中Saccharomyces屬有2 個種，Pichia屬有4 個種，其余各屬僅鑒定出一個種。每個種選出一個代表菌株與相應已知種的26S rDNA D1/D2進行比較，構建系統發育樹（圖1）。在系統發育樹上，分離菌株與相同的已知菌種被歸在一個主分枝內，表明它們具有較近的親緣關系，而不同的種卻位于不同的亞分枝上，顯示它們在D1/D2區域序列上具有明顯區別。上述結果表明，新疆馕面團含有相對豐富的酵母種類。

表1 馕面團采集地點及采集樣品、分離菌株、屬和種數量Table 1 Sampling location of ‘NNaanngg’ dough and the numbers of samples, yeast strains, genera and species

圖1 基于26S rDNA D1/D2區域序列和Neighbour-Joining分析繪制的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree drawn from Neighbor-Joining analysis based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment

2.2 酵母菌種群分布及優勢類群

在各地區分離到的酵母菌類型及數量見表2。由表2可知，上述地區馕面團酵母菌群分布不太均勻，各樣品中酵母菌的差異性很大。如S. cerevisiae在所有的采樣點均可發現；C. humilis、P. fermentans、P. membranifacies、P. kudriavzevii、T. delbrueckii、W. anomalus、C. ramotenellum等物種同時出現在2 個地區的樣品中；但是，S. servazzii、P. anomala、H. uvarum、C. albidus、K. ohmeri、I. orientalis等物種只在一個地區的樣品中出現，這可能與所使用的面粉、水的來源及區域環境有關。

表2 馕面團酵母種類及其地理分布Table 2 Distribution of yeast species in ‘Nang’ dough 株

在鑒定出的14 個種中，S. cerevisiae為優勢種，廣泛分布于6 個采樣地點的馕面團中，占總分離菌株的55.51%。C. humilis、P. fermentans這2 個物種所占比例比其他物種要高，分別占總分離菌株的11.45%和10.10%，但它們只在部分樣品中出現，所以不能認為是新疆馕面團中的優勢種，而只能是特定環境發酵條件中參入的菌群。

2.3 Saccharomyces cerevisiae進化分析

本研究發現S. cerevisiae為新疆馕面團的優勢種，在227 株菌中有126 株S. cerevisiae，占總分離菌株的55.51%，每個采樣地點的馕面團中均高頻率地出現。對馕面團中的S. cerevisiae菌株26S rDNA D1/D2區域序列進行進化分析，對它們的進化發育及多樣性分布情況進行檢測。如圖2所示，126 株菌株在系統發育樹上形成了A 和B兩個大分枝。相對于A枝，B枝是一個較小分枝，僅有9 株菌株構成。A分枝117 株菌株又分成A1（116 株）和A2（1 株）兩個亞分枝，其中A1枝又分成A1-1 （115 株）和A1-2（1 株）小分枝。從整體上看，A1-1分枝占據了126 株S. cerevisiae中的115 株，該分枝是新疆馕面團發酵酵母菌種適應性最強、分布面最廣、分化程度最高的酵母菌群。雖然這126 株菌株都屬于S. cerevisiae一個物種，具有共同的祖先，但它們在系統發育樹上形成2 個大分枝，4 個小分枝，結果顯示，不同的環境條件導致它們選擇了不同的進化與分化途徑，基因組結構上已產生了相應的堿基差異。

圖2 基于26S rDNA D1/D2序列構建的S. cerevisiae菌種的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 26S rDNA D1/D2 domain of S. cerevisiae

3 討 論

新疆地區具有獨特的氣候條件和特殊的地理環境，各地區的自然環境條件也存在著較大的差異，這對微生物資源的多樣性提供了較大的生存和選擇空間。研究結果顯示，在烏魯木齊、阿勒泰、伊犁、喀什、阿克蘇及和田6 個地區中，和田的馕面團發酵酵母菌多樣性最高，阿克蘇的馕面團總分離菌株最多，多樣性次于和田，這2 個地區的酵母菌群很相似；烏魯木齊、阿勒泰地區馕面團的分離菌株分別屬于4 個屬4 個種；喀什地區馕面團的總分離菌株較多，但是它們只屬于2 個屬4 個種；伊犁地區馕面團發酵酵母菌多樣性最低，分離株只屬于S. cerevisiae一個物種，可能是總分離菌株少而導致其他酵母菌種漏檢。上述結果揭示，新疆的馕面團發酵酵母菌資源豐富，每個地區酵母菌資源的分布有差異，這種差異與新疆各地區之間地理隔離與環境條件的差異相關。

研究還發現馕面團中存在P. anomala、C. ramotenellum、C. albidus、K. ohmeri等物種，數量較少，只在個別的樣品中出現，這些物種可能來自于采集地的水、面粉及空氣等周圍環境。烤制馕餅的過程中，發酵好的面團成形后放置于160 ℃以上的馕坑里烘烤0.5 h左右，因此成品中不可能有活的菌體存在，并且代謝產物中也沒有任何有害或有毒物質，一般不可能對馕制品食用者的健康造成危害。

在分離的227 株酵母菌中，126 株被鑒定為S. cerevisiae，占總分離菌株的55.51%，6 個采樣點中均可發現，是新疆地區馕面團樣品中的優勢種。這一結果與吳斯日古冷等[10]的報道相似。在系統發育樹上，126 株S. cerevisiae中有115 株聚集在A1-1分枝上，是新疆馕面團酵母中的優勢品系菌群，在馕面團發酵過程中起著關鍵性的作用。這一結果揭示同一種內突變品系的類型眾多，可為馕面團的發酵提供不同的代謝產物與不同的味感。這些馕面團發酵酵母菌株可能是本地區保存的特殊酵母品系，它們與酵母粉制品中的酵母是不同的酵母品種或品系。這也是新疆馕烤制工藝中依然采用傳統的民間馕面團發酵工藝，現代酵母粉產品未被新疆原居民廣泛采用和得到口感認可的原因。對土著酵母菌株的對比分析及其發酵代謝產物的深入探索研究極有可能為馕面團的現代化工業發酵提供優良酵母菌株。

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Yeast Diversity in Traditional Xinjiang ‘Nang’ Dough

Mihribangul ABDURUSUL, Marygul KURBAN, Nusratgul ANWAR, Ahmatjan AHAT, Tursunay MAMTIMIN, Akbar MUHTAR, Muhtar ABDUKERIM, Zulfi ya YUNUS*, Erkin RAHMAN*
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, ürümqi 830046, China)

Traditional ‘Nang’ (traditional Xinjiang food) doughs were sampled from ürümqi, Altay, Ili, Kashgar, Aksu and Hotan in Xinjiang Uygur Autonomous Region and investigated for yeast diversity by plate separation and purification, 26S rDNA D1/D2 sequence analysis and phylogenetic analysis. Totally 227 yeast strains were isolated and identified as belonging to 14 species in 10 genera, i.e., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces servazzii, Pichia fermentans, Pichia membranifacies, Pichia kudriavzevii, Pichia anomala, Candida humilis, Hanseniaspora uvarum, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Cladosporium ramotenellum, Cryptococcus albidus, Kodamaea ohmeri and Issatchenkia orientalis. S. cerevisiae was the most widely distributed and predominant species (126 isolates), representing 55.51% of all isolates. In the phylogenetic tree, S. cerevisiae formed two big and four small branches. Among them, A1-1 branch was constituted by 115 strains and were the most predominant strains of ‘Nang’ dough during fermentation. The diversity of yeasts in traditional ‘Nang’ dough can provide useful information for further utilization of yeasts in traditional fermented ‘Nang’ dough.

‘Nang’ dough; yeast; 26S rDNA D1/D2 region

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201519036

2014-12-23

烏魯木齊市科技創新種子資金項目（21061710）；國家自然科學基金新疆聯合基金項目（U1203101）；

國家自然科學基金地區科學基金項目（31060002）

米爾班古麗·阿卜杜如蘇力（1988-），女，碩士研究生，研究方向為資源微生物。E-mail：mihribangul@sina.com

*通信作者：祖麗皮亞·玉努斯（1970-），女，副教授，博士，研究方向為資源微生物。E-mail：zulfi ya_yunus@126.com

艾爾肯·熱合曼（1953-），男，教授，博士，研究方向為資源微生物。E-mail：erkin1106@163.com