雙孢蘑菇抗氧化肽的沒食子酸化修飾及其體外抗氧化活性

張 強 吳彩娥 祝嫦巍 訾士波 王 呈（.安徽科技學院生命科學學院，安徽 蚌埠 3300；.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院，江蘇 南京 0037）

近年來，有關抗氧化肽的研究引起了人們的高度關注，相關的研究主要集中在制備工藝的優(yōu)化、分離純化與結(jié)構表征以及抗氧化功能研究等方面［1］。酶法制備的抗氧化肽，由于受原料蛋白一級結(jié)構的限制，其抗氧化活性遠不如人工合成的抗氧化劑。因此，有必要對其進行適當?shù)男揎椧蕴岣咂渖飳W效用。美拉德反應［2］、類蛋白 反應［3］、自由 基降解［4］及高壓脈沖電場處理［5］等方法已用于抗氧化肽的結(jié)構修飾，均取得了較理想的效果，但將沒食子酸（GA）用于抗氧化肽結(jié)構修飾的相關研究國內(nèi)外尚未見報道。沒食子酸，又名五倍子酸、棓酸，化學名3，4，5－三羥基苯甲酸，廣泛存在于自然界，是一類分子中具有羧基和羥基的天然多酚類物質(zhì)［6］，藥理學研究［7］表明，GA具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗基因突變、抗腫瘤等多種功效，而且對正常細胞沒有毒副作用。GA作為一種抗氧化劑在食品、藥品和化妝品中已有廣泛應用［8］。另一方面，在一定的條件下，GA分子結(jié)構中的羧基可以和蛋白質(zhì)或肽分子中的羥基或氨基基團發(fā)生親核反應，其產(chǎn)物有望改善原食品蛋白質(zhì)或肽的功能特性，甚至可以賦予原蛋白質(zhì)或肽沒有的新功能［9］。本研究針對酶法制備的抗氧化肽生物學效用較低的問題，擬將雙孢蘑菇抗氧化肽（ABAP）與GA結(jié)合，對GA—ABAP的制備工藝進行探究，旨為活性肽類天然抗氧化劑的深入研究和開發(fā)提供一定的理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇抗氧化肽：本實驗室自制；

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；

菲洛嗪（Ferrozine）：美國Fluka公司；

鐵氰化鉀、氯化亞鐵、三氯乙酸等：分析純，市售。

1.1.2 試驗儀器

微波爐：MZ－2070EGZ型，青島海爾微波制品有限公司；

紫外可見分光光度計：TU－1810型，北京普析通儀器有限公司；

低溫冷凍離心機：Eppendorf 5804R型，德國Eppendorf公司；

紅外光譜儀：NICOLET 380型，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 GA—ABAP制備的單因素試驗

（1）加熱時間對GA—ABAP制備的影響：按體積比5∶1量取5mg/mL的GA和5mg/mL的ABAP，混于具塞試管中，用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)整溶液的pH至11.0，反應體系的總體積為10mL，將試管置于微波爐中加熱（先700W，沸騰后改為140W）一定時間（3，4，5，6，7，8min）后，立即于冰浴中冷卻，再用截留分子量300Da的透析袋透析48h，收集透析液，凍干，檢測產(chǎn)物的還原力。

（2）體積比對GA—ABAP制備的影響：按不同的體積比（1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1）量取5mg/mL的GA和5mg/mL的ABAP，混于具塞試管中，用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)整溶液的pH至11.0，反應體系的總體積為10mL，將試管置于微波爐中加熱（先700W，沸騰后改為140W）6min，然后立即于冰浴中冷卻，再用截留分子量300Da的透析袋透析48h，收集透析液，凍干，檢測產(chǎn)物的還原力。

（3）pH對GA—ABAP制備的影響：按體積比4∶1量取5mg/mL的GA和5mg/mL的ABAP，混于具塞試管中，用1mol/L的 HCl和 NaOH 調(diào)整溶液的pH（9.0，10.0，11.0，12.0，13.0），反應體系的總體積為10mL，將試管置于微波爐中加熱（先700W，沸騰后改為140W）6min，然后立即于冰浴中冷卻，再用截留分子量300Da的透析袋透析48h，收集透析液，凍干，檢測產(chǎn)物的還原力。

1.2.2 GA—ABAP制備的正交試驗 綜合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)L9（33）正交表進行正交試驗，以還原力為考察指標，對GA—ABAP的制備工藝進行優(yōu)化。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 ABAP結(jié)構變化的表征

（1）紫外—可見光譜分析：取適量的 ABAP、GA和GA—ABAP分別溶解于蒸餾水中，在190～700nm波長下進行掃描，記錄吸收峰的波長和強度，并繪制掃描圖譜。

（2）紅外光譜分析：將完全干燥的 ABAP和GA—ABAP分別與干燥的溴化鉀粉末混合，在瑪瑙研缽中研細均勻，置于模具中壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀于400～4 000cm－1進行掃描，檢測紅外吸收特征。

1.3.2 ABAP及GA—ABAP抗氧化活性測定

（1）還原力的測定：采用普魯士藍法［10，11］。吸光度值越大，還原力越強；

（2）對Fe2＋螯合能力的測定：采用菲洛嗪比色法［12］，按式（1）計算Fe2＋螯合率；

（3）清除超氧陰離子自由基能力的測定：采用硝基氯化四氮唑藍（NBT）光還原法［13］，按式（1）計算超氧陰離子自由基清除率；

（4）清除DPPH自由基能力測定：采用直接比色法［14］，按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：

R——螯合率（清除率），%；

A0——對照管的吸光度；

A——樣品管的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復測定3次，以平均值±標準差表示；數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA—ABAP制備的單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 加熱時間對GA—ABAP制備的影響 由圖1可知，隨著微波加熱時間的延長，修飾產(chǎn)物的還原力逐漸增加，當反應7min后，再延長反應時間，修飾產(chǎn)物的還原力變化不大，表明反應基本達到平衡，因此，選擇6～8min作為考察范圍。

圖1 加熱時間對GA—ABAP制備的影響Figure 1 Effect of heating time on GA—ABAP preparation

2.1.2 體積比對GA—ABAP制備的影響 體積比會影響GA與ABAP之間的有效碰撞從而影響修飾反應。由圖2可知，隨著GA在反應體系中所占比例的增加，修飾產(chǎn)物的還原力總體呈上升趨勢，當GA與ABAP的體積比為4∶1時，產(chǎn)物的還原力達到最大，再增大GA所占比例，產(chǎn)物還原力略有下降，可能是由于ABAP逐漸為GA所飽和的原因，因此選擇體積比3∶1～5∶1作為考察范圍。

圖2 體積比對GA—ABAP制備的影響Figure 2 Effect of volume proportion of GA to ABAP on GA—ABAP preparation

圖3 pH對GA—ABAP制備的影響Figure 3 Effect of pH on GA—ABAP preparation

2.1.3 pH對GA—ABAP制備的影響 pH會影響ABAP和GA上各種極性基團的解離，從而會影響修飾反應。由圖3可知，修飾產(chǎn)物的還原力隨pH的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，pH 10.0時修飾產(chǎn)物的還原力最大，可能是由于pH過高或過低時，ABAP和GA分子上各基團的解離狀態(tài)不利于反應的發(fā)生，因此選擇pH 9.0～11.0作為考察范圍。

2.2 GA—ABAP制備的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以體積比、pH、加熱時間為因素，進行L9（33）正交試驗，正交試驗設計見表1，正交試驗極差分析及方差分析結(jié)果分別見表2、3。

表1 正交試驗的因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

由表2可知，影響GA—ABAP制備的各因素的排列順序為A＞B＞C，即體積比＞pH＞加熱時間。由表2的K值可以看出，隨著體積比、pH或反應時間的增加，產(chǎn)物的還原力均呈增大的趨勢，但是，如果繼續(xù)增大體積比將會延長透析時間，并會造成GA的浪費；再增大pH使得反應條件不夠溫和；此外，反應時間對修飾反應的影響并不顯著（見表3），結(jié)合極差分析的結(jié)果，并考慮到生產(chǎn)實際，最終確定GA—ABAP制備的最佳工藝條件為A1B3C3，即GA與ABAP的體積比5∶1，pH 11.0，微波加熱時間8min。此外，本研究中，因素C的R值略低于空列組，可能是由于試驗設計中對影響修飾反應的因素考慮不夠全面，也或是因素C的水平步長設定太小，課題組后期將在此基礎上作進一步研究。

表2 正交試驗的極差分析表Table 2 Analysis of range table of orthogonal experiment

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment

＊＊表示影響極顯著（P＜0.01）。

因素 平方和 自由度 均方 F值 P值體積比 0.373 2 0.186 22.254 4 0.000 1＊＊ pH 0.155 2 0.077 9.243 3 0.001 4＊＊時間 0.033 2 0.017 1.976 9 0.164 7誤差e 0.049 7 2 0.024 8

2.3 ABAP結(jié)構變化的表征

2.3.1 紫外—可見光譜分析 GA、ABAP及按優(yōu)化條件制備所得GA—ABAP的紫外—可見光譜見圖4。ABAP在220nm有一個非常明顯吸收峰，GA在216，260nm處各有一個較強吸收峰，GA—ABAP的最大吸收峰位于209nm，相對于原ABAP的220nm發(fā)生了明顯的藍移，表明ABAP與GA之間的確發(fā)生了修飾反應，生成了一個新的產(chǎn)物。

圖4 GA、ABAP及GA—ABAP的紫外—可見光譜Figure 4 UV－Visible spectra of GA，ABAP and GA—ABAP

2.3.2 紅外光譜分析 由圖5可知，ABAP的—NH2吸收峰在3 436.70cm－1，GA—ABAP的—NH2吸收峰在3 425.13cm－1；ABAP的—COOH 吸 收 峰 在1 402.07cm－1，GA—ABAP 的—COOH吸收峰在1 411.71cm－1；ABAP的C—O吸收峰在1 643.14cm－1，GA—ABAP的C—O吸收峰在1 648.92cm－1，相對于ABAP，GA—ABAP的這4個吸收峰發(fā)生了明顯的位移。特別是GA—ABAP在1 533.21cm－1左右出現(xiàn)了一個新吸收峰，歸屬酰胺 N—H的彎曲振動［15，16］，在871.71cm－1處出現(xiàn)另外一個新吸收峰，歸屬苯環(huán)C—H面外的彎曲振動［17］，這表明GA與ABAP不是機械混合，而是發(fā)生了化學反應。

2.4 ABAP及其GA—ABAP的體外抗氧化活性

圖5 ABAP及GA—ABAP的紅外圖譜Figure 5 Infrared spectrum of ABAP and GA—ABAP

ABAP及GA—ABAP（濃度均為0.3mg/mL）的體外抗氧化活性見圖6。由圖6（a）可知，GA—ABAP的還原力顯著高于 ABAP（P＜0.01），大約是 ABAP的11.16倍，且優(yōu)于同濃度的2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT），但不及同濃度的抗壞血酸（Vc）；由圖6（b）可知，GA—ABAP對于Fe2＋的螯合能力優(yōu)于 ABAP（P＜0.01），比 ABAP提高了78.00%，但仍低于同濃度的Vc和乙二胺四乙酸（EDTA）；由圖6（c）可知，GA—ABAP對超氧陰離子自由基的清除能力較ABAP提高了109.80%（P＜0.01），幾乎與 Vc相當，并優(yōu)于同濃度的BHT（P＜0.01）；由圖6（d）可知，GA—ABAP對DPPH自由基的清除能力與Vc相當，并顯著高于BHT及ABAP（P＜0.01），大約是 ABAP的9.83倍。

圖6 ABAP及GA—ABAP的體外抗氧化活性Figure 6 In vitro antioxidant activities of ABAP and GA—ABAP

3 結(jié)論

ABAP的最佳修飾工藝為：GA與ABAP的體積比5∶1，pH 11.0，微波加熱時間8min；修飾后的ABAP抗氧化活性顯著提高，還原力和對DPPH自由基的清除能力分別為修飾前的11.16和9.83倍，對Fe2＋的螯合能力和對超氧陰離子自由基的清除能力分別比修飾前提高了78.00%和109.80%。

本研究采用的修飾方法具有時間短、成本低、修飾效果好等特點，可為其他抗氧化肽類天然抗氧化劑的研究開發(fā)提供參考，但研究過程中并未考慮樣品濃度及微波功率對修飾反應的影響，且僅研究了修飾物的體外抗氧化活性。因此，下一步將在本研究基礎上增加考察因素，結(jié)合響應面法進一步優(yōu)化修飾工藝，同時開展修飾物的體內(nèi)生物學效用研究。

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