大孔吸附樹脂對葵仁多酚的分離富集

徐丹丹 張文斌，2 楊瑞金，2 趙 偉，2 華 霄，2（.江南大學食品學院，江蘇 無錫 2422；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 2422）

葵花籽是重要的油料作物，其中含40%～60%的油脂和21%～31%的蛋白質［1］，此外還含有較為豐富的酚類物質，特別是綠原酸占總酚含量的70%以上［2］。綠原酸（chlorogenic acid，CGA）又名5－O－咖啡酰奎尼酸（5－O－CQA），是由奎尼酸和咖啡酸組成的縮酚酸，廣泛存在于植物食品中，由于其羥基取代的高反應性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性［3］。研究［4］發現，綠原酸等多酚類化合物具有延緩腫瘤發作、抑制腫瘤形成與低密度脂蛋白氧化及血小板凝集等功能，這些功能都與其抗氧化性能有關。此外，綠原酸還具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球和興奮中樞神經系統等多種藥理作用，是一種極具開發價值的潛在天然化合物［4，5］。

對于綠原酸類物質的分離富集，常用方法有沉淀法［6，7］、溶劑萃取法、超濾法［8，9］、大孔吸附樹脂法［10，11］。前兩者方法存在溶劑耗用量大、操作繁瑣、材料不易再生等缺點，相比而言，超濾和大孔吸附樹脂具有獨特的優勢。超濾膜分離技術具有操作簡便、無污染、在常溫下能連續操作等優點，特別適用于熱敏性物質［12］。根據目標物的分子量大小選取合適的超濾膜，可將提取液中的多糖、蛋白、鞣質等一系列大分子物質去除，達到分離純化目的。而大孔吸附樹脂則以高效、經濟等優勢越來越廣泛用于生物活性物質的分離純化，這是由于大孔吸附樹脂具有理想的孔徑結構和較大的比表面積。大孔樹脂根據化合物分子量、極性、分子形狀等差異用于黃酮、皂苷、生物堿的分離純化［13］，具有分離效果好，操作成本低、消耗溶劑少、容易再生等優點［14，15］。

目前，綠原酸主要從金銀花和杜仲葉中提取，而葵花籽作為一種酚類豐富的植物原料，很少用于酚類提取。同時，葵仁中由于存在綠原酸等酚類，易在加工時與蛋白質發生反應，影響蛋白的色澤和功能性質，導致優質蛋白和多酚的雙重浪費［16，17］。因此，本研究擬從葵仁中直接提取綠原酸類多酚，此粗提液經超濾初步純化后再采用大孔吸附樹脂進一步分離富集，以獲取純度較高的多酚類產品，實現葵仁資源的高附加值開發。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

脫殼葵仁：產自內蒙古河套地區，收獲于2014年秋；

鹽酸、乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

綠原酸：純度≥95%，美國Sigma－Aldrich公司；

咖啡酸：純度≥98%，美國Sigma－Aldrich公司；

大孔吸附樹脂：AB－8、D101、HPD850、NKA－9、NKA－Ⅱ、XDA－4、XDA16HP、XDA－1B、XDA－1型，鄭州勤實科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV－1100型，上海美譜達儀器有限公司；

高效液相色譜儀（配L2455DAD檢測器）：HITACHIL－2000型，日本日立公司；

超高效液相質譜儀：Waters Acquity UPLC型，美國Waters公司；

超級恒溫循環槽：MP－501A型，上海一恒科技有限公司；

超濾系統膜套：PLBC－C型，美國Millipore公司；

全溫培養搖床：QYC－2102型，上海新苗有限公司；

電腦全自動部分收集器：DBS－100型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

電腦數顯恒溫泵：DHL－A型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

實驗室pH計：FE20型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

離心機：LXJ－ⅡB型，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸類多酚粗提液制備及初步純化 取適量葵仁與0.001mol/L的鹽酸溶液以料液比1∶5（m∶V），在90℃下攪拌提取1.0h后，用紗布分離葵仁與浸提液，待浸提液冷卻后將其pH調至4.5，靜置一段時間后離心（5 000r/min，10min），抽濾，經截留分子量為3kDa的再生纖維素膜避光超濾后，得到澄清透明的提取液，調節pH至3.0，避光備用。

1.2.2 綠原酸類多酚含量的測定

（1）紫外分光光度法測定綠原酸含量的標準曲線：取10mg綠原酸標品稀釋定容至50mL的棕色容量瓶中，再取10mL定容至100mL，得20μg/mL的綠原酸溶液，分別稀釋成2，6，10，14，18μg/mL，在327nm下用紫外分光光度計測定，繪制吸光值—濃度曲線方程為y＝48.874x－0.001（R2＝0.999 9）。

（2）高效液相法測定綠原酸含量的標準曲線：色譜條件：Agilent Zorbax SB－C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈∶2%乙酸溶液＝15∶85（V∶V）；流速0.5mL/min；柱溫25℃；檢測波長327nm（DAD監測波長為190～400nm）；進樣量10μL。

標準曲線的制作：精確稱取50mg綠原酸標準樣品，用甲醇溶解至濃度1mg/mL，并進一步稀釋成0.75，1.5，3，15，75，150μg/mL。經0.22μm 微孔濾膜過濾后，進樣至HPLC測定。按上述色譜條件，以峰面積為縱坐標，溶質濃度為橫坐標，繪制綠原酸的標準曲線方程為y＝22 680.24x－9 820.20（R2＝0.999 8）。

（3）紫外分光光度法和高效液相色譜法測定多酚含量的相關性分析：將超濾處理后的多酚提取液稀釋成5種不同濃度，分別采用高效液相色譜儀和紫外分光光度計測定，以液相測定濃度（mg/mL）為橫坐標，紫外測定濃度（mg/mL）為縱坐標作相關性曲線，得到回歸方程：y＝1.229 5x＋0.000 1（R2＝0.999 4）。

由于紫外分光光度法和高效液相色譜法在測定多酚含量時具有較高的相關性，考慮到簡便，采用紫外分光光度法對多酚含量進行測定。

1.2.3 酸浸提液中產物種類的UPLC—MS/MS鑒定

（1）色譜條件：Waters Acquity BEH C18（2.1mm×100mm）色譜柱；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸，梯度洗脫：0～0.1min，2%A；0.1～8min，2% ～40%A；8～11min，40% ～100%A；11～12min，100%A。流 速0.3mL/min，檢測波長 327nm，DAD 檢測波長為 200～600nm，進樣量1μL。

（2）質譜條件：美國 Waters質譜儀。電噴霧離子化（ESI）源，離子源溫度為100℃，負離子檢測，毛細管電壓為3.0kV，錐孔氣流量為50L/h，脫溶劑溫度為400℃，脫溶劑氣體流量為500L/h，掃描范圍m/z為50～1 500。

1.2.4 大孔吸附樹脂靜態吸附及解吸

（1）樹脂預處理及水分含量測定：采用95%（V/V）乙醇浸泡樹脂24h，過濾，然后用去離子水洗滌至無醇味，布氏漏斗抽干待用。稱取濕樹脂各3g，精確到0.000 1g，并置于恒重過的水分盒中，于105℃下烘至恒重，計算樹脂的水分含量。

（2）樹脂的篩選：各稱取樹脂0.7g（濕基），裝入250mL的錐形瓶中，加入多酚濃度為2.0mg/mL的提取液200mL，在25℃、120r/min條件下振蕩吸附10h，吸附結束后測定殘余溶液中多酚的濃度。將上述已吸附的樹脂，用去離子水淋洗后，置于250mL錐形瓶，加入80%（V/V）的乙醇溶液200mL，在25℃、120r/min下恒溫振蕩解吸4h，測定解吸溶液中多酚的濃度。各樹脂的吸附量、解析量以及解析率分別按式（1）～（3）計算：

式中：

Qe——吸附量，mg/g·干樹脂；

C0、Ce——吸附前和吸附后溶液中的多酚濃度，mg/mL；

Vi——加入的多酚粗提液的體積，mL；

W——樹脂的干重，g；

Qd——解吸量，mg/g·干樹脂；

D——解吸率，%；

Cd——解吸液中多酚濃度，mg/mL；

Vd——解吸液體積，mL。

（3）吸附動力學曲線的繪制：稱取篩選后的濕樹脂0.7g置于250mL錐形瓶中，加入200mL、2.0mg/mL的多酚提取液，在25℃、120r/min條件下恒溫振蕩吸附，并每隔20min取樣測定殘余多酚含量，直至吸附達到平衡，繪制吸附動力學曲線。

（4）吸附初始pH的挑選：用0.1mol/L的鹽酸溶液將提取液的初始pH 分別調節至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，計算吸附后殘余溶液中多酚的濃度。并繪制以吸附量為縱坐標，pH為橫坐標的曲線。

（5）吸附等溫線的繪制：分別稱取0.7g濕樹脂于250mL錐形瓶中，加入200mL不同濃度（0.7～3.6mg/mL）的提取液，于25℃下以120r/min振搖吸附10h，測定吸附后殘液的多酚濃度。

1.2.5 大孔吸附樹脂動態吸附及解吸

（1）泄露曲線的繪制：稱取約18g濕樹脂裝于Φ1.0×30cm的層析柱中，其中樹脂的床體積（BV）為26mL，將濃度為2.0mL/L、pH 3.0的多酚提取液分別以2BV/h和4BV/h的流速進樣，5mL/管收集流出液并測定多酚濃度，直至流出液與上樣液的多酚濃度相等，此時樹脂已完全達到吸附飽和，停止進樣。繪制泄露曲線。

（2）梯度洗脫：將濃度為2.0mL/L、pH 3.0的多酚提取液以2BV/h的流速上樣30BV，用去離子水以2BV/h的流速洗去水溶性成分和樹脂間未吸附的多酚，再依次用10%，30%，50%，70%，90%（V/V）的乙醇溶液以4BV/h的流速洗脫7BV，測定各洗脫液的多酚濃度及純度。

（3）動態洗脫曲線的繪制：將濃度為2.0mg/mL、pH 3.0的多酚提取液以2BV/h的流速上樣30BV，經水洗后，先用10%（V/V）乙醇洗脫7BV，然后用50%（V/V）乙醇分別以1BV/h和4BV/h的流速洗脫收集，并經適當稀釋后測定多酚濃度，繪制洗脫曲線。

（4）產物純度的測定：將洗脫液于55℃下真空旋轉蒸發至30mL左右，置于培養皿，并用去離子水清洗殘余壁上的液體，合并后冷凍干燥。綠原酸類物質的純度定義為洗脫液中綠原酸類質量與干燥后總物質質量的比值。

1.3 數據處理

試驗得到的數據用SPSS 17.0統計軟件進行方差分析。用LSD檢驗判別數據之間的差異性，顯著差異水平P＜0.05。重復試驗3次，所得數據以均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 提取液成分的UPLC—MS/MS分析

由圖1可知，提取液中主要含4種化合物。經質譜（UPLC—MS/MS）進一步檢測分析（見圖2），酸液產物主要為綠原酸 （5－O－CQA）、新 綠 原 酸 （3－O－CQA）、隱 綠 原 酸 （4－OCQA）和未知化合物 X，其中5－O－CQA含量居多［18－21］。Nakatani等［22］研究表明3－O－CQA、4－O－CQA 和5－O－CQA具有相同的抗氧化能力。Kan等［23］也表明這3種物質在消除自由基和對抗癌細胞毒素能力方面幾乎沒差別。因此，綠原酸的異構化并不影響總酚的生物活性，將這3種物質一并進行富集回收。

圖1 葵仁90℃下酸浸提液的UPLC洗脫曲線Figure 1 UPLC elution curve of acid solution extract from intact sunflower kernel at 90℃

2.2 多酚粗提液的超濾純化

經浸提后，葵仁多酚粗提液的純度只有4%，且體系極不穩定，在低溫（4℃）下靜止1～2d便會有雜質的絮凝且變質。經截留分子量為3kDa的超濾膜初步純化后，多酚透過率達99%以上，蛋白截留為62%，粗提液純度達15%。雖然大部分的蛋白質可經超濾截留，但是殘余的蛋白質或多肽等雜質與多酚組成的體系仍不穩定，若要獲得多酚這類高生物活性的物質，考慮可采用大孔吸附樹脂進一步純化。

2.3 大孔樹脂靜態吸附及解吸條件的確定

2.3.1 樹脂的水分含量 測定了大孔吸附樹脂的水分含量，見表1。

圖2 UPLC洗脫峰的二級質譜圖Figure 2 MS/MS spectra of UPLC eluted peaks

表1 各樹脂的性能參數Table 1 Properties of the tested macroporous resins

2.3.2 大孔吸附樹脂的吸附量、解吸量和解吸率 由圖3可知，除了HPD850和XAD16HP外，其余7種樹脂對多酚都具有較高的吸附性能，特別是XDA－1、XDA－1B和NKA－Ⅱ樹脂對綠原酸類的吸附能力尤為顯著。至于解吸性能，這些樹脂都表現出良好的解吸能力，且解吸率都在80%以上。

圖3 葵仁多酚在9種不同樹脂上的吸附量、解吸量和解吸率Figure 3 Adsorption and desorption capacities，and desorption ratio of sunflower kernel polyphenols on different resins

綠原酸及其兩種異構體都含有羧基和5個羥基，為極性化合物。根據“相似相溶”原則，一般來說，極性化合物在極性樹脂上具有較好的吸附能力。雖然HPD850和NKA－Ⅱ同為極性樹脂，但是綠原酸類在這兩種樹脂上的吸附差異較大，分別為37.66，207.66mg/g。可見，極性并非是唯一的決定因素，樹脂的其他一些物理特性，如比表面積和平均孔徑都會影響綠原酸類物質的吸附效果，如XDA－4和XDA16HP同為非極性樹脂且比表面積相近，但是XDA－4的吸附量（93.07mg/g）要遠遠高于 XDA16HP（57.73mg/g），可能是由于平均孔徑的不同造成吸附能力的差異。事實上，除了以上這些樹脂的物理特性（極性、比表面積和平均孔徑），樹脂的化學成分和結構同樣也嚴重影響著吸附性能，如AB－8和XDA－1B具有類似的極性、比表面積和平均孔徑，但在吸附效果上卻有顯著差異。

在上述所選的非極性樹脂中，XDA－1具有非常大的比表面積，而XDA－1B樹脂帶有弱極性基團的吸附劑，是XDA－1樹脂的補充和改進，雖然比表面積小于XDA－1，但由于樹脂內部孔表面帶有弱極性基團，對水溶性差、從水相擴散到樹脂相阻力較大的有機物吸附速度快，吸附量大。此外，NKA－Ⅱ也表現出良好的吸附能力。綜合考慮，XDA－1、XDA－1B和NKA－Ⅱ更適合多酚的分離和純化，因此對于這3種樹脂將通過動態吸附試驗進行進一步篩選。

2.3.3 樹脂的吸附動力學曲線 由圖4可知，綠原酸類物質在3種樹脂上不僅有較高的吸附能力，還具有較好的吸附速率。在前100min內3種樹脂的吸附量迅速增加，到120min后基本趨于穩定，達到吸附平衡。XDA－1和XDA－1B比NKA－Ⅱ具有更高的吸附容量，同時XDA－1和XDA－1B二者的吸附容量和吸附速率不相上下，考慮到解吸量，最終選定XDA－1樹脂進行后續試驗。

圖4 葵仁多酚在3種樹脂上的吸附動力學Figure 4 Adsorption kinetics of sunflower kernel polyphenols on three different resins

2.3.4 初始pH對吸附量的影響 初始pH值對吸附量的影響相當明顯（見圖5）。pH值不僅改變了綠原酸及類似物在溶液中的狀態，同時也影響溶液流經樹脂時目標物在樹脂表面吸附能力的強弱。Sun等［24］研究5－O－CQA在極性樹脂ADS－21上的吸附行為時發現：當pH值為2時，綠原酸在樹脂上的吸附能力最大，隨著pH值增大，吸附能力逐漸下降。這是因為pH值決定了綠原酸分子的電離程度，由此影響吸附性能，且在極性樹脂吸附過程中，氫鍵可能起到非常重要的作用，若在高pH值下，酚羥基電離形成H＋和相應的陰離子，導致5－O－CQA和大孔吸附樹脂之間氫鍵作用減少。而本試驗所使用的XDA－1樹脂為非極性樹脂。由圖5可知，隨著pH增大，特別是當pH＞3時，綠原酸類的吸附能力明顯下降，這可能是因為在較低pH值下，綠原酸類物質是以分子狀態的形式存在于溶液中，易被樹脂吸附；當在較高pH溶液中，綠原酸類以離子狀態存在且難被樹脂吸附［25，26］。因此，較佳的吸附條件為pH≤3，考慮到pH 2和pH 3下，XDA－1對目標物的吸附能力相差不大（吸附量分別為432.48，424.41mg/g），因此將上樣溶液的pH值調節至3。

2.3.5 吸附等溫線 為了進一步揭示多酚在XDA－1樹脂上的吸附規律，分別采用Langmiur和Freundlich方程進行擬合。Langmiur方程描述的是較理想的單分子吸附，其模型通常表述為：

圖5 不同初始pH下葵仁多酚的吸附量Figure 5 Adsorption capacities of sunflower kernel polyphenols under different initial pH

式中：

Qe——吸附量，mg/g·干樹脂；

Ce——吸附后溶液中的總酚濃度，mg/mL；

Q0——經驗常數，與樹脂的吸附能有關；

K——吸附平衡常數，與最大吸附量有關。

而Freundlich方程適用于非理想的不均勻吸附，其模型表述為：

式中：

Qe——吸附量，mg/g·干樹脂；

Ce——吸附后溶液中的總酚濃度，mg/mL；

K——Freundlich常數，反映樹脂吸附能力大小；

1/n——經驗常數，表明樹脂的吸附強度。

由圖6可知，隨著初始濃度的增加，吸附量也隨之增加。從相關性程度（R2）來看，Langmiur方程（R2＝0.996 9）的相關性比Freundlich方程（R2＝0.986 9）的要高，說明Langmiur方程更加適合描述綠原酸類在XDA－1樹脂表面的吸附行為，同時表明綠原酸類在XDA－1樹脂表面的吸附是單分子層吸附。通常當1/n＜0.5時，表明吸附很容易發生；當0.5＜1/n＜1時，吸附發生較難；當1/n＞1時，吸附幾乎不可能發生［27］。由表2可知，Langmiur方程中1/n＝0.402 2，說明XDA－1樹脂比較適合綠原酸類的吸附。

2.4 大孔樹脂動態吸附及解吸條件的確定

2.4.1 上樣流速及上樣體積 樹脂對目標物的吸附能力并非是持續不變的，當樹脂吸附到達一定量時，樹脂對目標物的吸附作用會降低，進樣液便從樹脂柱上泄露。因此，確定上樣流速和上樣體積是非常必要的。一般而言，泄漏點是樹脂對目標物吸附能力突變的點，其范圍定義為流出液的濃度達到上樣液溶度的1%～10%。為了確定XDA－1樹脂對綠原酸類溶液吸附較佳的上樣流速和上樣體積，分別采用2BV/h和4BV/h的速度進行上樣，其泄露曲線見圖7。通過曲線分析，當流出液的濃度達到上樣液溶度的5%后，流出液中目標物的濃度急劇增大，說明此后XDA－1樹脂對目標物的吸附能力顯著降低，所以將Ct/C0＝5%定義為泄漏點，此點對應的上樣體積稱之為泄漏體積。當上樣流速定為4BV/h和2BV/h時，泄漏體積分別為20BV和30BV。假如將上樣流速降低到1BV/h，可能會使泄露體積增大，但是同時也大大增加了上樣的時間。因此在后續試驗中將上樣流速定為2BV/h，上樣體積定為30BV。

表2 葵仁多酚在XDA－1樹脂上的Langmiur和Freundlich的擬合方程Table 2 Langmiur and Freundlich equations for polyphenol adsorption isotherms on XDA－1resin

圖6 葵仁吸附等溫線的擬合Langmiur和Freundlich方程Figure 6 Fitting of adsorption isotherms with Langmiur equation and Freundlich equation

圖7 動態吸附條件下不同上樣流速時的泄露曲線Figure 7 The breakthrough curve at different flow rate under dynamic adsorption condition

表3 不同上樣流速下多酚在XDA－1樹脂上的泄露體積和吸附量Table 3 Breakthrough volume and capacity of polyphenols absorbed on XDA－1resin at different flow rate

2.4.2 梯度洗脫及組分純度 上樣結束后依次經不同濃度的乙醇梯度洗脫，其產物的洗脫比例和純度見圖8。雖然10%（V/V）乙醇能洗脫下13.7%的多酚類物質，但純度只有57%。大部分目標物質可以在30%（V/V）和50%（V/V）乙醇濃度下洗脫下來（洗脫比例分別為48.4%和33.5%），且純度都達到70%以上。70%（V/V）乙醇洗脫下2.2%的目標物，純度為47%，而90%（V/V）乙醇只洗脫下0.1%，純度只有9%。假如要獲得較高純度的多酚類物質，可先采用10%（V/V）乙醇洗脫除去純度較低的目標物，然后再用50%（V/V）乙醇洗脫收集。

圖8 葵仁多酚在XDA－1樹脂柱上的梯度洗脫Figure 8 Gradient elution of sunflower kernel polyphenols on XDA－1resin column

圖9 葵仁多酚在XDA－1樹脂柱上的動態解吸曲線Figure 9 Dynamic desorption curve of sunflower kernel polyphenols on XDA－1resin column

2.4.3 樹脂動態解吸曲線 采用10%（V/V）乙醇洗脫除去純度較低的多酚，再用50%（V/V）乙醇進行洗脫收集，其洗脫曲線見圖9。采用4BV/h的流速進行洗脫時，2h后基本洗脫完全，若將流速改為1BV/h，需要5h才能洗脫完全，大大延長了洗脫時間，不適于工業化生產，因此采用4BV/h的流速進行洗脫。經大孔吸附樹脂富集純化后，產物的回收率為82.3%，純度可由原來的15%提高到77%。

3 結論

將酸液用于葵仁多酚的提取，可獲取以綠原酸為主的大部分多酚，將此粗提液依次經超濾和大孔樹脂吸附解吸可實現富集純化。結果表明：經截留分子量為3kDa的超濾膜處理后，多酚透過率為99%，純度由4%提高到15%；超濾后的提取液經大孔吸附樹脂進一步富集，其優化工藝條件為多酚濃度2.0mg/mL、pH 3.0、上樣速度2BV/h、上樣體積30BV，此時吸附達到泄漏點；吸附結束后，先采用10%（V/V）的乙醇進行部分去雜，然后用50%（V/V）乙醇以4BV/h的速度進行洗脫收集，產品純度可由15%提高到77%，回收率為82.3%。超濾和大孔吸附樹脂聯合可適用于葵仁多酚的富集回收。

1 冷玉嫻.水酶法提取葵花籽油和葵花籽蛋白的回收［D］.無錫：江南大學，2007.

2 González－Pérez S，Vereijken J M.Sunflower proteins：overview of their physicochemical，structural and functional properties［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2007，87（12）：2 173～2 191.

3 Pajak P，Socha R，Gakowska D，et al.Phenolic profile and antioxidant activity in selected seeds and sprouts［J］.Food Chemistry，2014，143（12）：300～306.

4 陳少洲.油葵中綠原酸和咖啡酸的提取及對oxLDL誘導損傷內皮細胞的保護作用［D］.北京：中國農業大學，2003.

5 向福，馮鵬，劉亮，等.大孔樹脂對羅田金銀花葉中綠原酸的分離研究［J］.食品與機械，2013，29（4）：141～144.

6 張星海.金銀花中綠原酸提取、分離純化工藝和活性研究［D］.杭州：浙江大學，2003.

7 閻巧娟，韓魯佳，江正強.金銀花中綠原酸提取純化工藝的優化［J］.中國農業大學學報，2002，7（2）：22～26.

8 Gokmen V，Acar J，Kahraman N.Influence of conventional clarification and ultrafiltration on the phenolic composition of golden delicious apple juice［J］.Journal of Food Quality，2003，26（3）：257～266.

9 Wei S，Hossain M M，Saleh Z S.Concentration of rutin model solutions from their mixtures with glucose using ultrafiltration［J］.International Journal of Molecular Sciences，2010，11（2）：672～690.

10 鐘方麗，王曉林，王至敏，等.大孔吸附樹脂純化玉竹總黃酮工藝研究［J］.食品與機械，2013，29（1）：131～134.

11 Zhao Hui，Wang Jun，Jia Jing，et al.Enrichment and purification of total chlorogenic acids from tobacco waste extract with macroporous resins［J］.Separation Science and Technology，2010，45（6）：794～800.

12 楊祖金，江燕斌，葛發歡，等.超濾膜技術分離杜仲葉綠原酸的研究［J］.中藥材，2008（4）：585～588.

13 Bretag J，Kammerer D R，Jensen U，et al.Evaluation of the adsorption behavior of flavonoids and phenolic acids onto a food－grade resin using a D－optimal design［J］.European Food Research and Technology，2009，228（6）：985～999.

14 杜延兵，慕鴻雁，何忠寶，等.D101大孔吸附樹脂純化葵花籽粕綠原酸研究［J］.糧食與油脂，2013，26（6）：50～52.

15 Li Jing，Chase H A.Development of adsorptive （non－ionic）macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically－active natural products from plant sources［J］.Natural Product Reports，2010，27（10）：1 493～1 510.

16 Rosa P M d，Antoniassi R，Gonalves E B，et al.Extraction of chlorogenic acid from deffated sunflower meal［J］.Ciência Rural，2011，41（4）：719～724.

17 王志華.葵花籽飲料的研制以及綠原酸提取工藝的研究［D］.天津：天津科技大學，2004.

18 Zanoelo E F，Beninca C.Chemical kinetics of 5－O－caffeoylquinic acid in superheated steam：effect of isomerization on mate（Ilex paraguariensis）manufacturing［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（24）：11 564～11 569.

19 Karamac M，Kosinska A，Estrella I，et al.Antioxidant activity of phenolic compounds identified in sunflower seeds［J］.European Food Research and Technology，2012，235（2）：221～230.

20 Zhang Jia－yu，Zhang Qian，Li Ning，et al.Diagnostic fragmention－based and extension strategy coupled to DFIs intensity analysis for identification of chlorogenic acids isomers in Flos Lonicerae Japonicae by HPLC—ESI—MSn［J］.Talanta，2013，104：1～9.

21 Clifford M N，Johnston K L，Knight S，et al.Hierarchical scheme for LC—MSnidentification of chlorogenic acids［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（10）：2 900～2 911.

22 Nakatani N，Kayano S－I，Kikuzaki H，et al.Identification，quantitative determination，and antioxidative activities of chlorogenic acid isomers in prune（Prunus domesticaL.）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（11）：5 512～5 516.

23 Kan Shi－dong，Cheung M W M，Zhou Yan－ling，et al.Effects of boiling on chlorogenic acid and the liver protective effects of its main products against CCl4－induced toxicity in vitro［J］.Journal of Food Science，2014，79（2）：157～154.

24 Sun Peng－peng，Liu Ying，Yi Yue－tao，et al.Preliminary enrichment and separation of chlorogenic acid fromHelianthus tuberosusL.leaves extract by macroporous resins［J］.Food Chemistry，2015，168（2）：55～62.

25 Wang Jun，Lu Ding－qiang，Liang Yao，et al.Isolation of monocaffeoylquinic acids from tobacco waste using continuous resinbased pre－separation and preparative HPLC［J］.Journal of Separation Science，2012，35（10～11）：1 379～1 387.

26 Sun Li－jun，Guo Yu－rong，Fu Cheng－cheng，et al.Simultaneous separation and purification of total polyphenols，chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples［J］.Food Chemistry，2013，136（2）：1 022～1 029.

27 Zhang Bin，Yang Rui－yuan，Zhao Yan，et al.Separation of chlorogenic acid from honeysuckle crude extracts by macroporous resins［J］.Journal of Chromatography B，2008，867（2）：253～258.