MRP1基因表達與耐藥性癲癇的相關性研究

王 燕 張 慶河南安陽市第六人民醫院神經內科 安陽 455000 2）寧夏醫科大學總醫院神經內科 銀川 750004 3）寧夏顱腦疾病重點實驗室銀川750004

MRP1基因表達與耐藥性癲癇的相關性研究

王 燕1）張 慶2，3）△
1）河南安陽市第六人民醫院神經內科 安陽 455000 2）寧夏醫科大學總醫院神經內科 銀川 750004 3）寧夏顱腦疾病重點實驗室銀川750004

目的 研究MRP1基因表達與耐藥性癲癇的相關性。方法 選取90例符合診斷標準的癲癇患者，其中藥物敏感患者50例，癲癇耐藥患者40例。采用實時熒光定量PCR方法檢測癲癇患者外周血中MRP1基因mRNA的表達水平。結果 耐藥性癲癇組MRP1基因mRNA表達量（9.52±1.38）高于藥物敏感組（1），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 癲癇患者外周血中MRP1的表達水平，可作為診斷耐藥性癲癇的參考指標。

癲癇；耐藥性；MRP1基因；實時熒光定量PCR

癲癇是由多種病因引起的慢性腦功能障礙綜合征，以腦部神經元反復超同步放電所致的突然、反復和短暫的中樞神經系統功能失常為特征。經正規的抗癲癇藥物（antiepileptic drugs，AEDs）治療后，大部分患者癲癇發作可以控制或緩解，但仍有約30％的患者對各種AEDs不敏感，成為耐藥性癲癇［1-2］。關于癲癇的耐藥機制一直是研究熱點，但迄今為止仍未闡明。研究表明，多藥耐藥相關蛋白基因1（multidrug resistance-associated protein，MRP1）的高表達可能與癲癇耐藥存在一定的相關性。MRP1基因位于染色體16p13.1，轉錄一段7.8～8.2kb mRNA，編碼一種相對分子量為190的蛋白，命名為多藥耐藥相關蛋白1［3］。本研究中，我們對癲癇患者外周血中MRP1基因的mRNA表達水平進行檢測，進一步探討MRP1基因表達與癲癇耐藥的關聯。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組 本研究病例來源于2012-05—12在寧夏醫科大學附屬醫院神經內科癲癇門診就診的癲癇患者。納入標準：（1）經臨床發作和（或）腦電圖發現癇樣放電確診的癲癇患者，且經顱腦MRI或CT檢查未見進行性中樞神經系統疾病或占位病變；（2）入選本研究前，患者應用AEDs正規治療，且藥物血藥濃度在有效范圍內或己達臨床常用最大劑量。耐藥組［4-5］癲癇患者入選標準：入組前1a至入組時癲癇發作較前減少＜50％者；且影響日常生活；藥物敏感組［4-5］癲癇患者入選標準：入組前1a至入組時癲癇發作較前減少≥50％者；（3）患者本人或其監護人簽署知情同意書。排除標準：（1）服用MRP的底物類藥物（AEDs除外）和（或）抑制劑類藥物；（2）有嚴重器質性疾病、先天性代謝異常疾病或腦炎、腦腫瘤、腦血管病等患者；（3）妊娠或哺乳期婦女。

1.2 試驗儀器及試劑 熒光定量PCR儀（美國伯樂公司，iQ5），臺式離心機（德國HERMLE公司），DYY-6D電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統（BIO-RAD意大利米蘭）；紫外線分光儀（BIO-RAD美國）；HP1100高效液相色譜儀（安捷倫美國）。血液總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自Promega北京生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提?。翰杉d癇患者外周靜脈血約2mL，2h內用RNA提取試劑盒從血液中提取總RNA。所提取的總RNA經凝膠電泳檢測其完整性并使用紫外分光光度儀檢測其純度和濃度，要求A260／A280在1.8～2.0。

1.3.2 cDNA合成：反應體系：MgCl24μL，反轉錄10×緩沖液2μL，dNTP混合物2μL，重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5μL，AMV反轉錄酶15U，Oligo（dT）引物0.5μg，總RNA 1μg，加無核酸酶的水至終體積為20μL。反應條件：42℃溫育15min，95℃加熱5min，然后置于冰上5min，將cDNA放入-80℃冰箱保存，備用。

1.3.3 實時熒光定量PCR反應：根據Genebank人類MRP1基因的cDNA序列，應用引物設計軟件Primer 5.0設計引物，引物由上海生工生物技術有限公司合成，擴增產物為124bp：Premier F：5＇-GTCATCCTTGCTCTCTACCTCCT-3＇；Premier R：5＇-CCTGATACGTCTTGGTCTTCATC-3＇；以β-actin作為內參照，引物設計方法同上，擴增產物為205 bp：Premier F：5＇-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3＇，Premier R：5＇-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＇。反應體系：cDNA模板4μL，上、下游引物各1μL，Green qPCR SuperMix 12.5μL，加無酶水至25μL。反應條件：94℃變性5min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，重復40個循環；72℃7min，4℃保存。每例樣品設2個平行復孔，取平均值。反應結束后，由軟件自動得出熒光反應曲線以及每個標本反應體系的擴增效率（efficiency）及Ct值。

1.3.4 結果計算：本研究采用公式法（N＝2△△Ct）進行相對定量，比較不同基因的差異表達［6］。實驗結果計算如下：△Ct＝Ct目的基因-Ct內參，△△Ct＝△Ct樣品-△Ct基準。

1.4 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理，數據以均數±標準差表示，數據經正態檢驗后，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥組與敏感組癲癇患者一般資料比較 耐藥組與敏感組癲癇患者在性別、年齡、發病年齡、病程以及發作類型等方面比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 耐藥組與敏感組癲癇患者一般資料比較

2.2 2組MRP1和β-actin基因相對表達量比較 以藥物敏感組△Ct平均值作為校正數，結果顯示差異有統計學意義（P＜0.05），耐藥性癲癇組MRP1基因mRNA表達水平高于藥物敏感性癲癇組。結果見表2，擴增曲線見圖1。

表2 2組癲癇患者MRP1基因相對表達量比較

圖1 qPCR擴增曲線：A為MRP1基因擴增曲線，B為β-actin基因擴增曲線

3 討論

耐藥性癲癇的具體機制目前尚不清楚，隨著分子生物學技術的發展，越來越多的文獻證實，MRP1基因在耐藥性癲癇患者腦組織中過度表達，在癲癇耐藥中起重要作用［7］。其參與的耐藥機制可能為：MRP1在血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的血管內皮細胞過度表達，通過主動轉運的方式將作為其底物的AEDs從細胞內轉運至細胞外，使中樞致癇灶內的AEDs難以達到有效的抗癲濃度，從而導致癲癇耐藥［8］。

近年來通過抑制轉運體機制的動物實驗及在體微透析技術，證明多種AEDs為MRP1蛋白的底物。Van Vliet EA等［9］在誘導癲癇持續狀態的大鼠模型中，檢測到MRP1基因的高表達后，給大鼠模型肌注苯妥英鈉，與野生型大鼠比較，大鼠腦中與血中苯妥英鈉濃度比明顯低于野生型。Hoffmann等［10］將大鼠模型的MRP1基因敲除后，檢測大鼠腦細胞間液苯妥英鈉濃度較未敲除MRP1基因的大鼠明顯增高。Potschka等［11］給予小鼠微透析模型局部灌注MRP1抑制劑-丙磺舒后發現，丙戊酸鈉、苯妥英、卡馬西平等抗癲癇藥物的腦細胞外液濃度明顯提高。馬愛梅等［12］通過建立癲癇大鼠模型，同樣給予丙磺舒干預后，向大鼠腹腔內注射拉莫三嗪，發現丙磺舒干預組大鼠海馬神經元細胞外液拉莫三嗪血藥濃度明顯高于未干預組。以上研究表明卡馬西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、拉莫三嗪可能是MRP1的底物。為進一步探討MRP1基因與癲癇耐藥的關聯，我們從癲癇患者外周血中檢測MRP1基因的表達水平，并在癲癇耐藥組和藥物敏感組之間進行比較。結果發現耐藥組癲癇患者外周血中MRP1基因mRNA表達水平高于癲癇藥物敏感組（P＜0.05）?；仡櫦韧鶉鴥韧鈱RP1基因與癲癇耐藥的相關研究，結論與本研究一致。根據本研究結果我們推論：在耐藥性癲癇患者腦組織和外周血細胞中MRP1基因的表達水平可能是同步的，都呈過表達，且同樣參與了癲癇耐藥。今后我們可通過更進一步的研究探討兩者表達水平的確切關系及參與癲癇耐藥的具體機制。既往相關研究是從腦組織中取材檢測MRP1基因的表達水平，操作復雜，且不可能針對每一個癲癇病人，本研究則克服了上述缺點，取材簡單易行，快速檢測。關于MRP1基因高表達的具體機制，可能與基因多態性、癲癇發作頻率或長期應用AEDs有關，也可能是多種因素和機制共同作用的結果。

雖然引起耐藥性癲癇患者MRP1基因過表達的具體機制不是十分清楚，但其仍有顯著的臨床應用價值。通過檢測外周血中MRP1基因的表達水平，可作為一個診斷耐藥性癲癇的參考指標，預測評估癲癇耐藥，這就為我們臨床診斷耐藥性癲癇提供了客觀依據。在臨床工作中，可適時檢測外周血中MRP1基因的表達水平，充分發揮其臨床應用價值，如用藥前即檢測到MRP1基因呈高表達，則表示可能存在內源性多藥耐藥；如治療中檢測發現MRP1基因的表達逐漸升高，則提示有可能發生癲癇耐藥，可有針對性地選擇藥物，制定合理的方案，盡可能減少耐藥性癲癇的發生。早期識別耐藥性癲癇，有利于早期選擇合適的治療，改善患者的預后。對MRP1底物的研究，是為在癲癇治療上開辟新的途徑。如檢測到癲癇患者MRP1呈高表達，我們可避免應用作為其底物的AEDs，或在其基礎上添加MRP1抑制劑。目前研究發現，丙磺舒、磺吡酮、苯溴馬隆等可作為MRP1的抑制劑［13］，通過抑制腦組織中MRP1對藥物的外排作用及抑制耐藥性癲癇患者腦及其他臟器MRP1的高表達，從而加強抗癲癇作用。但鑒于MRP1抑制劑對中樞神經系統的不良反應，目前應用受限。故對MRP1底物及其抑制劑的進一步研究，是目前癲癇研究領域的新目標。

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（收稿2014-03-20）

Study on the correlation of between MRP1 gene expression and drug-resistance epilepsy

Wang Yan*，Zhang Qing
＊Department of Neurotogy，the sixth People＇s Hospital of Anyang，Anyang455001，China

Objective To investigate the correlation of between MRP1gene expression and drug-resistance epilepsy.Methods 90with epilepsy were divided into 50cases of AEDs sensitive patients and 40cases of AEDs resistance patients.The mRNA expression of MRP1gene was detected by Real-time fluorescent quantitation PCR.Results The mRNA expression quantity of MRP1gene in AEDs resistance patients was higher than that in AEDs sensitive patients（9.52±1.38vs 1），which had significant difference（P＜0.05）.Conclusion The expression level of MRP1gene in peripheral blood can be used an index to evaluate the drug-resistance epilepsy in epilepsy patients.

Epilepsy；Drug-resistance；MRP1gene；Real-time fluorescent quantitation PCR

R742.1

A

1673-5110（2015）02-0008-03

2011年度寧夏自治區科技攻關項目；2012年度寧夏醫科大學校級項目

△通訊作者：張慶，E-mail：nxzhangqing＠aliyun.com