丙戊酸代謝相關(guān)CYP2C19基因多態(tài)性在癲癇患兒體內(nèi)的分布及治療個(gè)體化研究

馮亞娟 周建華 劉科蘭 吳干斌

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院西藥學(xué)部 鄭州 450014

丙戊酸代謝相關(guān)CYP2C19基因多態(tài)性在癲癇患兒體內(nèi)的分布及治療個(gè)體化研究

馮亞娟 周建華 劉科蘭 吳干斌△

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院西藥學(xué)部 鄭州 450014

目的 對(duì)癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19的基因多態(tài)性進(jìn)行研究，并進(jìn)行基因型與患兒體內(nèi)丙戊酸血藥濃度關(guān)系的研究，以對(duì)患兒進(jìn)行治療個(gè)體化。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)對(duì)2012-12—2014-03來我院及其他醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科654例確診為癲癇患兒的CYP2C19基因型進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)僅服用丙戊酸進(jìn)行抗癲癇治療的228例患兒體內(nèi)的丙戊酸穩(wěn)態(tài)血藥濃度進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而探求CYP2C19的基因型與血藥濃度的相關(guān)性。結(jié)果 CYP2C19具有基因多態(tài)性，各基因型分布頻率不同，其中＊1/＊1型為41.9％、＊1/＊2型為41.1％、＊1/＊3型為6.4％、＊2/＊2型為7.4％、＊2/＊3型為2.9％和＊3/＊3型為0.3％；同時(shí)入選組的228例患兒中快、中、慢代謝型所占的頻率分別為40.8％、44.7％和13.5％；同時(shí)測(cè)得＊1/＊1型、＊1/＊2型、＊1/＊3型、＊2/＊2型、＊2/＊3型所對(duì)應(yīng)的穩(wěn)態(tài)血藥濃度（mg/L）分別為45±20、64±16、68±21、73±28、72±18；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，＊2/＊2型與＊1/＊1型血藥濃度體質(zhì)量劑量比值存在差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19具有多態(tài)性，其分布規(guī)律與其他正常人群的分布規(guī)律基本一致，患兒服用丙戊酸時(shí)，其CYP2C19基因型與體內(nèi)丙戊酸的血藥濃度具有相關(guān)性。因此提醒我們，對(duì)癲癇患兒應(yīng)用丙戊酸進(jìn)行抗癲癇治療時(shí)，可參考CYP2C19基因分型結(jié)果，預(yù)測(cè)血藥濃度變化，對(duì)患兒進(jìn)行個(gè)體化的治療。

CYP2C19；基因多態(tài)性；癲癇患兒；丙戊酸；血藥濃度

癲癇是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，以腦神經(jīng)元異常放電引起反復(fù)癇性發(fā)作為特征，具有發(fā)病率高、療程長(zhǎng)、治愈率低特點(diǎn)。臨床治療中主要以長(zhǎng)期合理使用抗癲癇藥物為主。小兒癲癇發(fā)病率高，可達(dá)到2％～7％。

丙戊酸是臨床常用的廣譜抗癲癇藥物，但其血藥濃度、療效和不良反應(yīng)存在顯著的個(gè)體差異，因此在臨床應(yīng)用中需要對(duì)患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)（TDM）。同時(shí)在使用過程中發(fā)現(xiàn)有“耐藥”現(xiàn)象的產(chǎn)生。研究表明，CYP2C19在體內(nèi)可參與丙戊酸的代謝過程，其多態(tài)性會(huì)影響到體內(nèi)血藥濃度的高低，進(jìn)而影響藥物的療效，與“耐藥”現(xiàn)象的產(chǎn)生有關(guān)［1-4］。本文擬通過對(duì)癲癇患兒的CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行研究，進(jìn)而探求基因多態(tài)性與患兒體內(nèi)丙戊酸血藥濃度的相關(guān)性，從而為癲癇患兒提供個(gè)體化給藥方案。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 DNA提取及擴(kuò)增試劑盒，有上海某公司提供；ABI9902型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)AB公司生產(chǎn)；BR526-24型全自動(dòng)雜交儀，上海某公司生產(chǎn)；BE-2.0型生物芯片識(shí)別儀，上海某公司生產(chǎn)；5424R型高速離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司生產(chǎn)；HYC-260型醫(yī)用冷藏箱，青島海爾公司生產(chǎn)；TDX SYSTEM型快速血藥濃度檢測(cè)儀，美國(guó)雅培公司生產(chǎn)；其余耗材及試劑均為國(guó)產(chǎn)

1.2 研究對(duì)象 研究對(duì)象是2012-12—2014-03來我院及其他醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為癲癇的654例患兒，均簽署知情同意書，漢族，彼此之間無血緣關(guān)系。年齡3個(gè)月～12歲，男448例，女206例，否認(rèn)癲癇家族史。入組行基因型和丙戊酸血藥濃度相關(guān)性研究的患兒（由上述654例患兒中選出）標(biāo)準(zhǔn)是：僅為癲癇患兒，無其他并發(fā)癥，單獨(dú)使用丙戊酸，無聯(lián)合用藥，肝腎功能無異常，取血時(shí)間為建立穩(wěn)態(tài)血藥濃度時(shí)；剔除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他病癥，存在聯(lián)合用藥現(xiàn)象，肝腎功能異常，取血時(shí)間點(diǎn)不規(guī)范。入組進(jìn)行相關(guān)性研究的癲癇患兒228例，年齡6個(gè)月～12歲，男164例，女64例，平均年齡（5.0±4.1）歲，平均體質(zhì)量（16.5±11.3）kg，服用丙戊酸的劑量平均值（375±235）mg/d。

1.3 研究方法

1.3.1 提取DNA：取654例癲癇患兒的外周血1mL（EDTA抗凝），提取試劑有上海某公司提供，按照相關(guān)操作流程進(jìn)行DNA提取。

1.3.2 PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系25μL：擴(kuò)增液和反應(yīng)液共計(jì)20 μL，DNA模板5μL；PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；再在72℃條件下延伸5min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 分析CYP2C19基因型：根據(jù)基因多態(tài)性對(duì)藥物的代謝能力的強(qiáng)弱，將患者分為三種：弱代謝型（PM，雙位點(diǎn)突變型）；中間代謝型（IM，單位點(diǎn)突變型）；強(qiáng)代謝型（EM，野生純合子型）。其中強(qiáng)代謝型的基因型為＊1/＊1型；中間代謝型的基因型為＊1/＊2和＊1/＊3型；弱代謝型的基因型為＊2/＊2、＊2/＊3和＊3/＊3型［5］。有上海某公司提供的全自動(dòng)雜交儀將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，應(yīng)用單堿基延伸結(jié)合微陣列芯片法對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序，最終通過生物芯片識(shí)別儀讀出CYP2C19（636、681位點(diǎn)）的基因分型。

1.3.4 測(cè)定丙戊酸鈉血藥濃度：228例癲癇患兒服用丙戊酸5個(gè)半衰期，體內(nèi)藥物濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，于下次用藥前抽取靜脈血，熒光偏振免疫法測(cè)定丙戊酸血藥濃度。為了避免丙戊酸劑量以及患兒體質(zhì)量對(duì)血藥濃度的影響，我們對(duì)血藥濃度進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理：將實(shí)驗(yàn)測(cè)定的血藥濃度除以患者每日每公斤體質(zhì)量的服藥劑量（血藥濃度/體質(zhì)量劑量）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用χ2檢驗(yàn)和方差分析對(duì)各組進(jìn)行比較；同時(shí)進(jìn)行Hardy—Weinberg定律的吻合度測(cè)驗(yàn)，檢驗(yàn)各等位基因頻率是否符合遺傳學(xué)規(guī)律［6］；并對(duì)基因型和體內(nèi)血藥濃度的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；所有檢測(cè)均雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型及其分布概率 我們對(duì)654例癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19的第636位和第681位兩個(gè)位點(diǎn)堿基的突變進(jìn)行檢測(cè)，基因型圖示如圖1所示，另6種基因型在654例癲癇患兒中的各自分布頻率見表1。

圖1 CYP2C19各基因型生物芯片識(shí)別圖

表1 654例癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19各基因型的分布頻率

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)等位基因頻率在性別間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.76，P＞0.05）。通過計(jì)算檢測(cè)符合Hardy-Weinberg平衡定律，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 入組進(jìn)行基因型與丙戊酸血藥濃度相關(guān)性研究 228例癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19各基因型分布頻率經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析同樣發(fā)現(xiàn)等位基因頻率在性別間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.35，P＞0.05），同時(shí)和654例患者的基因型的分布概率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 入組相關(guān)性研究的228例癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19各基因型的分布頻率

2.3 CYP2C19各基因型與體內(nèi)丙戊酸血藥濃度的關(guān)系

由于入選組樣本量偏小（僅228例），我們經(jīng)過整理沒有發(fā)現(xiàn)＊3/＊3型（636AA，681GG）的患兒，各基因型血藥濃度及血藥濃度/體質(zhì)量劑量結(jié)果見表3。結(jié)果中我們看到＊2/＊2型（636GG，681AA）（突變型）血藥濃度體質(zhì)量劑量比值明顯高于＊1/＊1型（636GG，681GG）（野生型），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各基因型與血藥濃度的關(guān)系

3 討論

丙戊酸是臨床上常用的抗癲癇藥物之一，由于它抗癲譜比較廣，療效比較確切，價(jià)格比較低廉，因此在小兒癲癇患者中得到了廣泛的應(yīng)用。但在臨床中發(fā)現(xiàn)服用該藥后體內(nèi)的血藥濃度存在很大的個(gè)體差異，對(duì)于很多患者會(huì)出現(xiàn)消化系統(tǒng)、肝臟及血液系統(tǒng)的毒性，甚至出現(xiàn)致死性肝壞死（兩歲以下患兒多見）［7］。鑒于個(gè)體差異等方面的原因，在使用上述藥物進(jìn)行抗癲癇治療時(shí)需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。

隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)臨床中常用的抗癲癇藥物丙戊酸主要經(jīng)CYP2C19代謝［1，8-90］。CYP2C19又稱為S-美芬妥英羥化酶，其存在基因多態(tài)性，會(huì)導(dǎo)致其活性存在明顯的個(gè)體差異，影響著很多藥物的代謝［10-13］。

我們對(duì)654例癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19的第636位（G→A突變）和第681位（G→A突變）兩個(gè)位點(diǎn)堿基的突變進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因具有多態(tài)性，在癲癇患兒中發(fā)現(xiàn)有6種基因分型，各基因型分布概率與其他正常人群中的分布概率基本一致［14-16］。在癲癇患兒中，強(qiáng)代謝型（EM）的分布概率為41.9％，中間代謝型（IM）為47.5％，弱代謝型（PM）為10.6％。其中對(duì)于強(qiáng)代謝型與文獻(xiàn)報(bào)道的45.7％為低，中間型與文獻(xiàn)報(bào)道的38.3％較高，而對(duì)于弱代謝型與文獻(xiàn)報(bào)道的16.0％為低［16］。從本文的結(jié)果來看，有58.1％的癲癇患兒體內(nèi)CYP2C19的基因存在缺陷（發(fā)生單突變或雙突變），也就是說有近六成的癲癇患兒在服用常規(guī)劑量的丙戊酸進(jìn)行抗癲癇治療時(shí)，會(huì)因?yàn)檠帩舛壬叨鸷芏喾矫娴牟涣挤磻?yīng)，該數(shù)據(jù)與一篇文獻(xiàn)［17］報(bào)道的56.9％接近。

通過研究CYP2C19基因型和患兒體內(nèi)丙戊酸血藥濃度的相關(guān)性我們發(fā)現(xiàn)，各基因型的患兒體內(nèi)丙戊酸的血藥濃度有很大的差異，各基因型中，野生型的血藥濃度最低，高低順序?yàn)椋?/＊1型（636GG，681GG）＜＊1/＊2型（636GG，681GA）＜＊1/＊3型（636GA，681GG）＜＊2/＊3型（636GA，681GA）＜＊2/＊2型（636GG，681AA）。而血藥濃度/體質(zhì)量劑量的順序?yàn)椋?/＊1型（636GG，681GG）＜＊2/＊3型（636GA，681GA）＜＊1/＊2型（636GG，681GA）＜＊1/＊3型（636GA，681GG）＊2/＊2（636GG，681AA），這與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致［17-20］。結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究CYP2C19基因突變后血液中抗癲癇藥物如丙戊酸、苯巴比妥、苯妥英的濃度均會(huì)升高的結(jié)論是一致的。由于入組的樣本量較小，我們只發(fā)現(xiàn)了五種基因型，而未發(fā)現(xiàn)＊3/＊3型（636AA，681GG）。鑒于初步的研究結(jié)果，我們下一步擬對(duì)癲癇患兒的體質(zhì)量劑量和血藥濃度分階段進(jìn)行比較，并擴(kuò)大樣本量進(jìn)行試驗(yàn)，以期獲得基因型和血藥濃度之間更為確切的相關(guān)性。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，服用標(biāo)準(zhǔn)劑量的丙戊酸后弱代謝型和中間代謝型患兒的丙戊酸血藥濃度均高于強(qiáng)代謝型患兒，這就提示我們?cè)趯?duì)患兒進(jìn)行抗癲癇治療之前可以對(duì)患兒CYP2C19基因型進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于CYP2C19基因型存在突變的癲癇患兒，可以使用較小劑量的丙戊酸，以期達(dá)到控制癲癇發(fā)作同時(shí)減少不良反應(yīng)發(fā)生的目的，進(jìn)而為癲癇患兒實(shí)現(xiàn)真正意義上的個(gè)體化用藥。

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（收稿2014-06-12）

R742.1

A

1673-5110（2015）05-0049-04

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14A350014）

△通訊作者：吳干斌，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)。

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