補陽還五湯對大鼠急性脊髓損傷后血清中MBP蛋白含量的影響

李俊杰 梁舒涵 趙 鵬 彭 奇 林 斌 饒耀劍

（1湖南中醫藥大學2009級中醫七年制骨傷，長沙410007；2福建中醫藥大學骨傷學院碩士研究生2012級，福州350122；3湖南中醫藥大學2008級中醫七年制骨傷，長沙410007；4河南省洛陽正骨醫院河南省骨科醫院脊柱外三科，洛陽471002）

補陽還五湯對大鼠急性脊髓損傷后血清中MBP蛋白含量的影響

李俊杰1梁舒涵1趙 鵬2彭 奇3林 斌3饒耀劍4*

（1湖南中醫藥大學2009級中醫七年制骨傷，長沙410007；2福建中醫藥大學骨傷學院碩士研究生2012級，福州350122；3湖南中醫藥大學2008級中醫七年制骨傷，長沙410007；4河南省洛陽正骨醫院河南省骨科醫院脊柱外三科，洛陽471002）

目的探討補陽還五湯對大鼠脊髓損傷（SCI）后血清中髓鞘堿性蛋白（MBP）含量的影響。方法將45只大鼠隨機分為模型組、補陽還五湯（BYHWT）組、假手術組（n=15）；假手術組單純咬除T10椎板，不損傷脊髓，模型組及BYHWT組均采用Allen’s垂直打擊法來制備T10節段SCI大鼠模型，術后第1天，BYHWT組開始給予BYHWT濃縮液灌胃，于造模后3d、7d、14d行大鼠后下肢BBB評分并用腹主動脈采血法取血提取大鼠血清，通過E lisa法檢測各組血清中MBP蛋白含量情況。結果BYHWT治療后，血清中MBP含量較模型組明顯下降，BBB評分較模型組模型升高。結論BYHWT能減少SCI后MBP釋放，減少SCI血清中MBP蛋白含量，從而減輕髓鞘組織的退變促進神經功能恢復。

脊髓損傷；髓鞘堿性蛋白；補陽還五湯；實驗研究；痹證

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指直接或間接暴力導致脊髓灰質和白質受損，神經傳導通路中斷，從而出現相應節段的感覺、運動和括約肌功能障礙，肌張力異常及病理反射等的改變［1］。髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）是膜蛋白成分，只存在于神經系統中，在中樞神經系統由少突膠質細胞合成，在周圍神經由雪旺氏細胞合成。MBP是髓鞘中心的主要成分，在髓鞘外周存在較少。有研究顯示［2］脊髓損傷后損傷部位的缺血及炎癥和免疫反應可導致血脊髓屏障的破壞，使MBP可以進入血液循環。近年來，在基礎實驗及臨床方面，關于補陽還五湯治療脊髓損傷的研究報道逐漸增多，其療效也令人滿意，但其對MBP的影響研究鮮見報道，因此本實驗運用中醫藥與現代醫學結合的思維并遵循整體治療原則，來探究補陽還五湯對大鼠SCI后血清中MBP蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑4月齡清潔級SD大鼠45只，體重在220～300g之間，不拘雌雄（合格證號：SCXK（豫）2010-0002），購自河南省實驗動物中心。大鼠MBP酶聯免疫分析盒（武漢博士德生物有限公司）等。

1.2 實驗分組及脊髓損傷動物模型的建立45只大鼠，隨機分成補陽還五湯（BYHWT）組、模型組、假手術組，每組各15只，適應性喂養1w后準備造模。3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉后，用Allen’s垂直打擊法［3］制造大鼠SCI模型，打擊高度5cm，重量10g，直徑2mm，打擊成功可見大鼠尾巴出現痙攣性擺動，雙下肢軀體回縮樣撲動，呈遲緩性癱瘓。假手術組只行T9-11椎板咬處，不予以打擊。

1.3 術后護理及給藥造模后大鼠分籠單籠飼養；造模后每天給予每只SD大鼠肌肉注射青霉素約8萬U一次，連續3d；造模后每日3次定時人工排尿。BYHWT組大鼠于術后次日分別在每日早9時、下午4時用BYHWT濃縮液（BYHWT原方水煎至95ml制成相當于含生藥1.5g/ml的水煎劑）灌胃，每次灌胃劑量按“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算臨床等效劑量，按60kg體重人每天l劑換算，200g大鼠等效用藥劑量約為4.34g（分兩次灌胃），連續灌胃14d。模型組及假手術組不予灌胃處理。

1.4 BBB評分造模前每只大白鼠BBB功能評分均為21分，造模后再予BBB功能評分，分別在術后3d、7d、14d行BBB功能評分。各個時間點分3組實驗人員進行，取平均值［4］。

1.5 酶聯免疫吸附檢測法（Elisa）各組動物于損傷后3d、7d、14d隨機選取5只大鼠經腹主動脈取血致死，置于4℃冰箱2h，待其凝固后放入離心機經1500r/min15min，分離出血清置于-80℃冰箱保存備用。Elisa法嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行檢測。

1.6 統計學分析造模后死亡大鼠及時補充，制取標本時必須保證每組樣本量為15。用SPSS17.0軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，完全隨機設計多個樣本均數間的比較若符合正態分布及方差齊性，則采用單因素方差分析進行分析；若不符合正態分布則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異性標準。

2 結果

2.1 BBB評分比較（1）3組大鼠SCI前BBB評分比較無差異（P＞0.05）；（2）BYHWT組和模型組大鼠SCI前后BBB評分比較有顯著性差異（P＜0.05）；（3）7d、14d，BYHWT組與模型組相比，BBB評分有顯著性差異（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠各時間點的B B B功能評分（±s）

表1 各組大鼠各時間點的B B B功能評分（±s）

術前術后3d術后7d術后14d B Y H W T組21．00±0．001．32±0．313．46±0．567．57±0．48模型組21．00±0．001．15±0．351．56±0．363．31±0．32假手術組21．00±0．0018．56±0．4118．32±0．3219．31±0．38

2.2 血清中M B P蛋白含量比較（1）BYHWT組及模型組大鼠造模后3d、7d、14d各時間點血清中MBP蛋白含量與假手術組比較有顯著性差異（P＜0.05）；（2）BYHWT組大鼠造模后3d、7d、14d各時間點血清中MBP蛋白含量與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠各時間點血清中M B P蛋白含量（μg/l，±s）

表2 各組大鼠各時間點血清中M B P蛋白含量（μg/l，±s）

術后3d術后7d術后14d B Y H W T組4．32±1．415．96±1．466．57±1．48模型組5．65±1．357．16±1．368．31±1．32假手術組1．56±1．411．87±1．321．67±1．38

3 討論

中樞神經系統（Central Nervous System，CNS）髓鞘的蛋白質主要由MBP組成，約占髓鞘蛋白質總量的30%。其位于髓鞘多層膜結構的漿面，與髓鞘脂質緊密結合，維持CNS髓鞘結構和功能的穩定。由于血腦屏障的作用，髓鞘堿性蛋白較易釋放到腦脊液，僅小量釋放入血液。研究表明［5］當CNS出現實質性損害，特別是出現髓鞘脫失時，構成髓鞘主要蛋白質的髓鞘堿性蛋白也與其結合的脂質分離，并通過破壞的脊髓血腦屏障入血。腦脊液（Cerebro-Spinal Fluid，CSF）和血液中MBP此時可急劇升高［6］。楊喜明等［7］研究指出了在脊髓損傷及腦損傷后血清及腦脊液中MBP濃度的平行性及中樞神經損傷嚴重程度的正相關。Buss［8］等在通過對SCI大鼠脊髓組織進行免疫組化檢測，觀察到在SCI組織中許多神經細胞體皺縮并且組織呈海綿狀水腫表現，其內存在一個膠質細胞原纖維酸性蛋白免疫應答的顯著增加和MBP染色的明顯減少。

補陽還五湯是補氣活血通絡的代表方。補陽還五湯方源自清·王清任《醫林改錯》，由生黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花組成，具有補氣活血化瘀之效，主治“半身不遂……遺尿不禁”。方中生黃芪為君藥，大補脾胃之元氣，使氣旺血行，瘀祛絡通；臣藥當歸尾，長于活血，兼能養血，因而有化瘀而不傷血之妙；佐藥赤芍、川芎、桃仁、紅花，有助于當歸尾活血祛瘀，地龍通經活絡。本方運用大量補氣藥與少量活血藥相配，氣行則血行，活血而不傷正，共奏補氣活血通絡之功。已有較多實驗研究發現，補陽還五湯對SCI改善癥狀、脊髓功能恢復有積極治療作用，其機制可能為：（1）抑制脂質過氧化反應；（2）促進軸突再生作用；（3）抑制細胞死亡，保護神經細胞；（4）降低血小板活化因子含量，抑制水通道蛋白-4的表達，改善損傷后組織的缺血和炎癥反應。

本研究通過用BYHWT對大鼠SCI模型進行干預，發現BYHWT能減少MBP入血，從而降低SCI大鼠血清中MBP蛋白含量，進而提高大鼠BBB評分，促進其神經功能恢復。但是目前對MBP的研究尚處于起步階段及BYHWT對SCI中MBP的影響研究也處于起步階段，其具體作用機制尚不明確，今后我們會進一步深化研究，為其廣泛應用于臨床提供理論依據。

［1］胥少汀，葛寶豐，徐印坎．實用骨科學［M］．4版．北京：人民軍醫出版社，2012：645-646．

［2］劉暉，尹慶水，夏虹，等．甲強龍對兔急性脊髓損傷后血、組織髓鞘堿性蛋白表達的影響［J］．中國骨與關節損傷雜志，2006，21（3）：191-193．

［3］Allen AR．Surgery for experimental lesions of spinal cord equivalent to cr-ushinjury of fracture dislocation of spinal column：a preliminary report［J］．JAMA，1911，57（4）：878-880．

［4］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC．A sensitive and reliable locomotor rating scale for open filed testing in rats［J］．Neurotrauma，1995，12（1）：1-21．

［5］賀玉君，秦新民，黃明，等．髓鞘堿性蛋白的研究及進展［J］．廣西中醫學院學報，2004，7（2）：75-79．

［6］Omana Zapata I，KhabbazMA，HunterJC，et al．QX-314inhibits ectopic nerve activity associated with neuropathicpain［J］．Brain Res，1997，771（2）：28．

［7］楊喜民，李栓德，楊術真．血清與腦脊液髓鞘堿性蛋白檢測的比較及臨床意義［J］．陜西醫學檢驗，1998，13（1）：4．

［8］BussA，BrookGA．Gradual loss of Myelin and Formation of an As trocytic Scar during Wallerian Degeneration in the HumanSpinal Cord［J］．Brain，2004，127（1）：34．

LI Junjie1， LIANG Shuhan1， ZHAO Peng2， peng Qi3， LIN Bin3， RAO Yaojian4
（1. Grade2009Graduate of Seven-Year-System， Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha410007， China；2. Grade2012Graduate， Orthopedics College， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou350122， China；3. Grade2008， Hunan university of traditional Chinese medicine， Hunan，Changsha，410007；4. Spinal Surgical Department， Luoyang Orthopedic-traumatological Hospital， Henan Province， Luoyang471002， China）

Objective To investigate the effect of Buying Huanwu decoction（BYHWT）on MBP protein content in serum of rats after acute spinal cord injury.Methods45rats were randomly divided into model group，BYHWT group，the sham group（n=15）.The sham group was bit T10laminectomy，without spinal cord injury.The model group and BYHWT groups were prepared T10segment SCI rats by Allen's vertical combat.On the first day after the operation，BYHWT group was diven gavage with BYHWT.Upon modeling3d，7d and14d，Rats' behavior were scored by BBB score，the serum of rats were taken by abdominal aortic blood，the content of MBP in serum were detect by Elisa.Results After BYHWT treatment，the serum MBP content was significantly lower than that of the model group，and the BBB score was higher than that of the model group.Conclusion BYHWT can reduce the release of MBP after SCI and the content of MBP in serum，thereby reduce the degeneration of myelin tissue and promote the recovery of nerve function.

spinal cord injury；MBP；Buying Huanwu decoction；experimental study；bi syndrome

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.17.074

1672-2779（2015）-17-0142-02

：張文娟本文校對：趙鵬

2015-07-07）

*通訊作者：670570572@qq.com