Nanog與CD44在胃癌細胞株MKN45球體細胞中的表達及其意義

劉建明，周友浪，馬利林，徐駿飛，章建國

Nanog與CD44在胃癌細胞株MKN45球體細胞中的表達及其意義

劉建明，周友浪△，馬利林，徐駿飛，章建國

目的檢測與干細胞相關的2種因子胚胎干細胞相關轉錄因子4（Nanog）和分化抗原簇44（CD44）在胃癌細胞株MKN45懸浮球體細胞中的表達。方法選擇人胃癌細胞株MKN45，在含有表皮生長因子（EGF）及成纖維生長因子（bFGF）無血清培養液中培養，觀察球體形成情況；采用免疫印跡（Western blot）、免疫熒光與實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測干細胞相關基因Nanog和CD44在球體細胞及原代貼壁細胞中的表達差異。結果胃癌細胞株MKN45在無血清培養條件下能形成懸浮球體，球體細胞中的Nanog和CD44的mRNA相對表達量分別為2.34±0.22和1.18±0.04，明顯高于貼壁細胞中的Nanog和CD44的mRNA相對表達量1.00±0.00和1.00±0.05；球體細胞中的Nanog和CD44的蛋白質相對表達量分別為0.18±0.02和0.24±0.04，明顯高于貼壁細胞中的相對表達量0.07±0.02和0.18±0.01（P＜0.05）。球體細胞中Nanog主要分布在細胞核周圍及細胞質中，而CD44主要在細胞膜上表達，且同一個球體細胞中的Nanog與CD44大多同時表達。結論胃癌細胞株MKN45在無血清培養條件下形成的球體細胞具有腫瘤干細胞的特性。Nanog/CD44共表達細胞可能是胃癌干細胞的一種表型。

胃腫瘤；腫瘤干細胞；抗原,CD44；懸浮培養法；Nanog

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是腫瘤的起源，它決定腫瘤發生進展、治療抵抗和復發轉移[1-2]。針對CSC的研究，首要的任務是CSC的分離與鑒定。懸浮培養法是近年來用來分離CSC一種方法。Zhang等[3]研究發現，前列腺癌細胞株在無血清的懸浮培養系統中能形成腫瘤球，進一步研究證實，這些腫瘤球細胞中的CSC標志物分化抗原簇44（cluster of differentiation 44,CD44）以及其他干性基因神經膠質瘤致病基因1（Gli1），腺苷三磷酸結合盒轉運體G2（ABCG2）與B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點（Bmi-1）基因的表達水平增高。吳庭楓等[4]用神經干細胞培養基培養膠質瘤細胞株，獲取其膠質瘤干細胞球，發現這種膠質瘤干細胞屬于CDl33+A2B5-亞群，高表達血管內皮生長因子受體-2（VEGFR-2），具有自我更新及多向分化潛能，可參與血管擬態的形成。然而，懸浮培養法應用于胃癌干細胞分離的相關報道極為罕見。本文采用懸浮培養法在胃癌細胞株MKN45中分離球體細胞，并檢測其與干細胞相關的胚胎干細胞相關轉錄因子4（ES cell associated transcripts4，Ecat4，又名Nanog）和分化抗原簇44（cluster of differentiation 44，CD44）在胃癌細胞株MKN45懸浮球體細胞中的表達。

1 材料與方法

1.1 材料人胃癌細胞株MKN45購自上海中科院細胞庫；N-2添加劑及B-27添加劑購自Invitrogen公司；青鏈霉素及培養液購自Gibco公司；人成纖維生長因子-2（basic Fibroblast Growth Factor-2，FGF-2）及表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）購自Chemicon公司；Nanog、CD44抗體及電化學發光（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）試劑購自Santa Curz公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）與4%甲醛購自Sigma公司，Evagreen TM qPCR Master Mix購自Biotium Inc公司；Trizol Reagent試劑盒購自Qiagen公司；PCR引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人胃癌細胞株MKN45在含10%胎牛血清（FBS）的1640培養液中培養，細胞貼壁以后，收集貼壁細胞置于含無血清的1640培養液96孔超低黏附板中培養，培養液中加入1%N-2添加劑、2%B-27添加劑、1%青鏈霉素、20 μg/L人FGF-2和100 μg/L EGF，觀察懸浮球形成情況，每孔100個細胞，2周后在倒置顯微鏡（Olympus）下觀察懸浮球形成情況（40及100倍）。當形成的懸浮球長到單個球體含200～500個細胞時，將懸浮球溶解成1 000個/mL細胞的溶液，按每孔100 μL單細胞懸液植入含無血清培養液的96孔的超低黏附板中，2周后觀察第二代懸浮球形成情況，貼壁細胞作為對照組觀察成球情況。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）以懸浮球體細胞為實驗組、貼壁細胞為對照組，分別取1×106個細胞提取總RNA，按照Trizol Reagent試劑盒說明書進行。分光光度計檢測RNA濃度，取1 μg RNA按照逆轉錄試劑盒進行合成cDNA，PCR反應體系為50 μL，包括25 μL混合物，上、下游引物各1 μL[分別為Nanog、CD44、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物]，2 μL cDNA模板，雙蒸水補足到50 μL。95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增40個循環。熒光定量PCR(7500)檢測各基因的表達，引物序列見表1，操作步驟及加樣劑量按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行，每組重復實驗3次，結果用7500 System Software V 2.0分析,以GAPDH基因為內參，根據公式2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達量。

Tab.1The base sequences of primers for quantitative real-time PCR表1 實時定量聚合酶鏈反應引物序列

1.2.3 蛋白免疫印跡分析懸浮球或貼壁細胞經含有蛋白酶抑制劑的裂解液裂解并提取蛋白樣本，然后添加變性緩沖液后煮沸備用，用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）在8%或12%的凝膠中分離并轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛奶封閉后加入一抗，在4℃條件下孵育過夜（抗-Nanog 1∶500，抗-CD44 1∶500），洗膜緩沖液（TBST）洗3次，然后加入標記辣根過氧化物酶的二抗，室溫下培養2 h，TBST洗3次，最后，蛋白條帶經ECL化學發光試劑曝光于膠片（Kodak）上。

1.2.4 免疫熒光分析將懸浮球細胞及貼壁細胞在室溫下用4%甲醛固定15～20 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，在含10%的羊血清及0.1%Triton X-100的封閉液中封閉10 min，去除封閉液，分別加入Nanog和CD44抗體，在4℃下孵育過夜（抗-Nanog 1∶200，抗-CD44 1∶200），PBS替代原抗體作為陰性對照，PBS洗3次，加入標記異硫氰酸熒光素或羅丹明的相應二抗，用DAPI染細胞核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件包分析數據，所有實驗至少重復3次，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞懸浮球體的形成胃癌MKN45細胞在無血清培養基中培養7 d即開始形成細胞球體，培養至14 d球體基本形成，中心密度増高。培養21 d左右球體完全形成，球體結構飽滿，細胞排列致密，中心密度更高，見圖1。第1代球體細胞吹散后在無血清培養基中繼續培養，能繼續形成細胞球體，成球率達（29.70±6.21）%，高于原代細胞的成球率為（3.30±1.49）%，差異有統計學意義（t=13.052，P＜0.05）。

Fig.1The spheroid body of gastric cancer cell line MKN45 observed in serum-free condition圖1 胃癌細胞株MKN45在無血清培養條件下所形成的懸浮球體

2.2 球體細胞中干細胞相關基因的表達定量PCR顯示，球體細胞中干細胞相關基因Nanog、CD44的表達明顯高于原代貼壁細胞，見表2。蛋白免疫印跡條帶顯示球體細胞的Nanog及CD44的表達明顯高于原代貼壁細胞，見圖2、表3。免疫熒光分析顯示，球體細胞中Nanog主要分布在細胞核周圍及細胞質中，而CD44主要表達于細胞膜上，且同一個球體細胞中的Nanog與CD44大多同時表達，見圖3。而Nanog在原代貼壁細胞中表達微弱，CD44僅在部分原代貼壁細胞中表達，見圖4。

Tab.2Comparison of the expression levels of Nanog and CD44 mRNA between spheroid cells and parental cells表2 2組細胞干細胞相關因子mRNA實時定量PCR分析結果（n=3，）

Tab.2Comparison of the expression levels of Nanog and CD44 mRNA between spheroid cells and parental cells表2 2組細胞干細胞相關因子mRNA實時定量PCR分析結果（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別原代貼壁細胞球體細胞t Nanog 1.00±0.00 2.34±0.22 10.288＊＊CD44 1.00±0.05 1.18±0.04 4.386＊

Fig.2Western blot results for Nanog and CD44 proteins in spheroid cells and parental cells圖2 球體細胞與原代貼壁細胞中Nanog、CD44電泳圖

Tab.3Comparison of expression levels of Nanog and CD44 protein between spheroid cells and parental cells表3 2組細胞干細胞相關因子蛋白表達量的比較（n=3，）

Tab.3Comparison of expression levels of Nanog and CD44 protein between spheroid cells and parental cells表3 2組細胞干細胞相關因子蛋白表達量的比較（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別原代貼壁細胞球體細胞t Nanog 0.07±0.02 0.18±0.02 5.886＊＊CD44 0.18±0.01 0.24±0.04 3.084＊

3 討論

3.1 懸浮培養法分離胃癌球體細胞懸浮培養法是將候選細胞在含bFGF及EGF的無血清培養液中培養，能形成懸浮球體的細胞被認為是CSCs[5]。文獻報道懸浮培養法已分別在前列腺癌[3]、膠質瘤[4]以及大腸癌[6]等許多實體腫瘤中成功分離、鑒定出CSC，而應用于胃癌干細胞的分離、鑒定的相關研究報道極為罕見。本研究選用胃癌細胞株MKN45在含人EGF及bFGF的無血清的培養液中培養，結果顯示有一小部分細胞能夠形成懸浮球體，且懸浮球體細胞在無血清培養條件下的成球率明顯高于原代貼壁細胞，提示懸浮球體細胞富集具有自我更新與增殖能力的胃癌干細胞。

3.2 Nanog及CD44在腫瘤懸浮球體細胞中的表達意義Nanog作為一種同源異型結構域轉錄因子，在維持鼠胚胎干細胞的多能性、阻止胚胎干細胞向原始內胚層分化方面發揮至關重要的作用。近年來研究表明，懸浮培養法分離的球體細胞中的Nanog表達明顯高于原代貼壁細胞。韓興文等[7]用無血清培養法從骨肉瘤細胞株U2-OS和MG-63中培養出懸浮球，RT-PCR檢測Stro-1陽性細胞（間充質干細胞）、Stro-1陰性細胞及懸浮球細胞中Nanog mRNA的表達，結果顯示Stro-1陽性細胞和懸浮球細胞Nanog mRNA表達水平均高于Stro-1陰性細胞的表達水平。王涌等[8]采用無血清培養基結合耐藥篩選法在肝癌細胞系SMMC-7721中培養出懸浮球體，定量PCR、免疫熒光法檢測Nanog、CD24等腫瘤干細胞標志物的表達，結果發現懸浮球體細胞中的Nanog、CD24等腫瘤干細胞標志物明顯高于普通肝癌細胞。提示Nanog基因可能在維持懸浮球體細胞自我更新及其未分化狀態過程中發揮重要作用。

CD44是一種多功能的跨膜糖蛋白，在許多正常組織細胞及腫瘤組織中都有表達[9],也是在實體腫瘤中最早用來分離鑒定CSC的標志物之一[10]。Fan等[6]采用懸浮球培養法在大腸癌細胞株HT29中成功培養出懸浮球體細胞，進一步研究發現懸浮球體細胞中CD44(+)細胞所占比例（89.5%）是原代貼壁細胞中CD44(+)細胞所占比例（1.3%）的68倍，CD133(+)/CD44(+)細胞所占比例從原代貼壁細胞中的0.6%上升到5.4%，球體細胞中醛脫氫酶1（Aldehyde dehydrigenase1,ALDH1）的表達（20.5%）高于原代貼壁細胞（7.5%），并且球體細胞對5-氟尿嘧啶（5-Fu）的耐受性比原代貼壁細胞強，提示懸浮培養法是富集大腸癌干細胞的有效方法，為大腸癌干細胞的研究提供了一種穩定有效的細胞模型。楊宏瓊等[11]采用克隆形成實驗在人胃癌細胞株SGC-7901中培養出3種類型的克隆，即緊密型、中間型和松散型克隆。采用免疫熒光技術和Western blot法檢測不同克隆細胞中CD44和CDX2的表達，結果顯示CD44在緊密型克隆細胞中的表達明顯強于中間型和松散型克隆，因而推測緊密型克隆可能富含胃癌干細胞。

3.3 Nanog及CD44在胃癌球體細胞中的表達意義為了進一步證實懸浮培養法分離的懸浮球體細胞的干細胞特性，本研究對胃癌細胞株MKN45懸浮球體細胞中的干細胞相關因子Nanog及CD44做了檢測，結果顯示，球體細胞中Nanog、CD44表達均明顯高于原代貼壁細胞中的表達，表明胃癌細胞株MKN45在無血清的培養液中培養出的懸浮球體細胞具有類似腫瘤干細胞的分子基礎。免疫熒光顯示原代貼壁細胞中Nanog表達微弱，證實隨著細胞的分化，Nanog的表達水平降低或消失；CD44僅在部分原代貼壁細胞中表達，提示CD44在部分已分化的細胞中也能表達，其并非干細胞的特異性標志物。同一球體細胞中Nanog與CD44大多同時表達，提示Nanog/CD44共表達細胞可能是胃癌干細胞的一種表型。

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（2014-04-19收稿2014-08-12修回）

（本文編輯李鵬）

（圖3、4見插頁）

The expression and significance of Nanog and CD44 in spheroid body-forming cells of gastric cancer cell line MKN-45

LIU Jianming,ZHOU Youlang△,MA Lilin,XU Junfei,ZHANG Jianguo
Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001,China△

ObjectiveTo detect the expression of stem-cell related factors Nanog and CD44 in spheroid body-forming cells of gastric cancer cell line MKN-45.MethodsThe gastric cancer cell line MKN-45 was used to culture spheroid bodies in non-adherent condition in a serum-free medium supplemented with epidermal growth factor(EGF)and basic fibroblast growth factor(bFGF).Using Western blot analysis,immunofluorescence staining and quantitative real time polymerase chain reaction（qRT-PCR）,the expression levels of stem cell-related genes Nanog and CD44 were studied.ResultsIn this study,we observed that MKN45 cells formed spheroid bodies in non-adherent condition in a serum-free medium,and the levels of Nanog and CD44 mRNA expression in spheroid body-forming cells were 2.34±0.22 and 1.18±0.04，respectively, which were higher than those in parental cells(1.00±0.00 and 1.00±0.05).The levels of Nanog and CD44 protein expression in spheroid body-forming cells were 0.18±0.02 and 0.24±0.04,respectively,which were significantly higher than those in parental cells(0.07±0.02 and 0.18±0.01,P＜0.05).Nanog protein was positively stained within the perinuclear and cytoplasm of the spheroid body-forming cells,and CD44 was positively stained mainly in the membrane.Dual staining of Nanog/CD44 indicated that the embryonal protein Nanog was co-localized with CD44 in the spheroid body-forming cells.Conclusion Spheroid body-forming cells developed from human gastric cancer cell line MKN-45 in serum-free medium supplemented with EGF and bFGF show characteristics of cancer stem cell(CSC).The cells co-expressed of CD44 and Nanog maybe a phenotype of gastric CSCs.

stomach neoplasms；neoplastic stem cells；antigens,CD44；suspension culture；Nanog

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.008

江蘇省南通市科技局資助項目（HS2012067）

南通大學附屬醫院普外科（郵編226001）

劉建明（1965），男，主任醫師，副教授，博士，主要從事胃癌的基礎與臨床研究

△通訊作者E-mail：liujmtq1@163.com