贛西油茶人工林土壤微生物群落的多樣性

郭春蘭，張 露，葉素瓊 ，雷 蕾，吳南生

（1.江西農業大學 園林與藝術學院，江西 南昌 330045；2.江西環境工程職業學院，江西 贛州 341000）

贛西油茶人工林土壤微生物群落的多樣性

郭春蘭1，張 露1，葉素瓊2，雷 蕾1，吳南生1

（1.江西農業大學 園林與藝術學院，江西 南昌 330045；2.江西環境工程職業學院，江西 贛州 341000）

為了解油茶林土壤微生物群落結構特征，揭示油茶林土壤微生物群落結構多樣性變化特征對林齡和季節等環境因素的響應機制，為油茶林合理經營管理提供理論依據，以贛西地區新余市渝水區不同林齡油茶林24個土壤樣品為研究對象，采用變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術分析油茶林土壤細菌群落多樣性。DGGE指紋圖譜分析結果表明，油茶林土壤微生物類群的細菌多樣性較豐富，各個樣品的條帶數目穩定分布在13～36條。10年齡油茶人工林細菌基因多樣性較為豐富，集約經營10年齡油茶林的細菌物種數量多。細菌豐富度和Shannon-Wiener多樣性指數在林齡變化上均表現為中齡林（2個10年齡）＞成熟林（30年齡、50年齡）＞幼齡林（1年齡、6年齡）；其在季節變化上均呈一致的變化規律，為夏季＞秋、冬季＞春季。細菌16S rDNA的系統發育分析結果表明，大多數序列與未培養細菌的同源性較高，所有序列與數據庫中16S rDNA序列的相似性在84%～99%。遺傳關系研究得到主要的優勢菌為泛菌屬Pantoea sp.、腸桿菌屬Enterobacter sp.。

油茶林；土壤微生物；PCR-DGGE；細菌群落多樣性

土壤微生物是土壤的重要組成部分，不僅能夠改善土壤的結構，促進土壤養分轉化與循環，更能為地上植被儲備養分，促進植物的吸收，增強植物的抗性[1]。微生物群落的組成和活性影響著生物地球化學循環、有機物的代謝過程以及土壤的肥力和質量[2]，也制約著林分類型的分異和演替[3]。由于土壤中只有不到l%的微生物是可培養的，且傳統培養微生物的方法，很難真實全面地反映土壤微生物群落的變化[4]，變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術可以克服傳統培養法造成的土壤微生物信息大量丟失的缺點，獲得未培養的全部微生物資源，豐富土壤宏基因組文庫，并能更精確地揭示土壤微生物種類和遺傳多樣性[5-7]。近年來，PCR-DGGE分子生物技術廣泛應用于微生物多樣性研究，涉及湖泊、草地、濕地、熔巖、農田和食品等各個領域，在森林土壤微生物多樣性研究中的應用也日趨增多[8-10]，這些研究均表明PCR-DGGE技術可以很好地彌補傳統培養法的不足，能夠較全面分析土壤微生物多樣性。目前，油茶林土壤研究主要集中于施肥[11]、套種模式[12]和撫育方式[13]等對油茶林土壤養分及微生物的影響，這些研究主要采用的是傳統的化學分析法，且大多數研究僅僅是對油茶林土壤基本養分的探討[14-16]，關于油茶林土壤微生物群落結構多樣性的相關報道甚少[17]。因此，本研究中以贛西地區江西省新余市渝水區不同林齡油茶林土壤為研究對象，基于16S rDNA V3區片段的PCR-DGGE技術和克隆測序比對來研究油茶林土壤細菌群落結構特征變化，分析林齡和季節變化對土壤微生物群落結構多樣性的影響，以揭示其多樣性對林齡和季節的響應機制，為油茶林科學種植管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與研究樣地

樣品采集標準地按0～20 cm土壤層次，用直徑為7.5 cm的土鉆在每個樣方分別以“S”形采集5個土壤樣品，將每個樣方的5個樣品混合為1個樣品帶回實驗室分析。采集時間分別在2011年10月（秋季），2012年1月（冬季），2012年4月（春季），2012年7月（夏季）。供試材料為6種不同類型油茶人工林及對照灌叢土壤。不同類型油茶人工林主要有幼齡林（1年齡、6年齡），中齡林（2種不同撫育方式的10年齡），成熟林（30年齡、50年齡）。不同撫育方式為集約經營管理和粗放經營管理。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤微生物總DNA的提取及檢測

方法參照Zhou[18]提出的方法并加以改進，采用化學裂解法直接從土壤樣品中提取基因組DNA。

（1）取2 g土壤置于10 mL離心管中，加入裂解液，12 000 r/min離心10 min，棄上清。

（2）向沉淀的土壤中加入3 mL SDS裂解液，200 μL Tris飽和酚和0.3～0.4 g的玻璃珠，渦旋震蕩5 min，68 ℃溫浴l h，每10 min輕輕搖動1次，12 000 r/min離心10 min。

（3）移取上清液至干凈的10 mL離心管中，加入250 μL NH4Ac，－20 ℃至少沉淀15 min，12 000 r/min離心10 min。

（4）移取上清液至干凈的10 mL離心管中，加入5 mL苯酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比25∶24∶1）和3 mL Tris飽和酚，12 000 r/min離心10 min，重復2次。

（5）移取上清液至1個新的10 mL離心管中，加入等體積異戊醇，－20 ℃放置3 h。

（6）4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，棄上清，使用體積分數為70%的冰乙醇，洗滌沉淀2次，自然干燥。加40 μL的TE或無菌水溶解保存備用。

（7）提取的DNA通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA完整性。

1.2.2 聚合酶鏈式反應（PCR）

根據文獻[19]～[21]，自行設計其特異性擴增引物，序列如表1所示，全部引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR反應體系如表2所示。PCR擴增程序為：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共 30 個循環；72 ℃，7 min。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

參照Muyzer等[21]的方法，對16S rDNA的擴增產物進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）。使用8%聚丙烯酰胺凝膠，將100%變性梯度定義為包含體積比40%的甲酰胺和7 mol/L尿素。電泳采用DCodeTM Universal Mutation Detection System（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA），首先在220 V電壓下預電泳10 min，隨后在85 V的固定電壓下電泳10 h。電泳結束后，進行硝酸銀染色[22]。應用凝膠分析軟件Quantity One 4.40對掃描所得的DGGE圖譜進行條帶識別和分析。

表 1 用于PCR擴增的引物Table 1 Primer sequences for PCR amplification

表 2 PCR反應體系Table 2 Reaction system of PCR

1.2.4 條帶測序

DGGE特殊條帶的測序和分析[23-24]：使用無菌刀片仔細將PCR-DGGE的特定條帶從膠上切割下來，使用1×PCR buffer沖洗2次，最后將其搗碎，浸入40 μL 1×PCR buffer中，4 ℃過夜。以其作為PCR模板，重新進行擴增，PCR體系模板量為5 μL，其它條件同1.2.2。取5 μL PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，陽性結果取10 μL用于DGGE，凡經過重新PCR后的產物在DGGE膠上為單一條帶的，然后切膠回收，將PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序部測序。

1.2.5 數據分析

采用Bio-Rad Quantity One 4.40對掃描所得的DGGE圖譜進行條帶識別和分析，將基因序列均提交 Genbank數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行基因序列比對，采用DNAStar，MEGA構建系統發育樹。

同時微生物多樣性指數的計算公式如下：

（1）香農多樣性指數（Shannon's diversity index）

其中，“S”表示總的物種數，“pi”表示第i個種占總數的比例。當群落中只有1個居群存在時，香農指數達最小值0；當群落中有2個以上的居群存在，且每個居群僅有1個成員時，香農指數達到最大值lnk。

（2）物種均一度（Species Evenness）

物種均一度用來描述物種中個體的相對豐富度或所占比例。群落的均一度可以用Pielou均一度指數J表示（Pielou’s evenness index，J）：

其中，H′為香農指數，H′max是H′的最大值。

2 結果與分析

2.1 細菌總DNA的提取與純化

從油茶人工林土壤微生物DNA提取的結果來看（見圖1），均能提取到23 kb左右的條帶，各林分提取的基因組DNA條帶明亮，無彌散現象。條帶較明亮的林分，表明已獲得較長片段的土壤基因組DNA，適合土壤細菌16S rDNA分析。所提取的土壤總DNA中都有部分色素和腐植酸成分，直接影響PCR擴增，進一步對提取的土壤總DNA進行純化，從而得到質量較高的土壤DNA模板。

2.2 細菌的PCR擴增分析

所提取的DNA溶液純化后直接用于PCR擴增反應，選擇16S rDNA片段帶GC夾的338～518作為PCR擴增的引物是進行引物篩選后的結果。DNA溶液純化并稀釋100倍后進行PCR擴增出現了相應的條帶，均獲得特異性擴增片段，大小在148～169 bp的為16S rDNA V3片段（見圖2），能夠進行下一步的DGGE圖譜分析。

2.3 細菌16S rDNA的DGGE圖譜分析

將土壤樣品的16S rDNA V3區PCR擴增產物進行DGGE電泳，得到6種類型油茶人工林土壤細菌的DGGE圖譜（見圖3和圖4）。圖譜顯示，油茶人工林土壤細菌DGGE圖譜的條帶數和條帶位置存在一定程度的差異，土壤樣本檢出了數目不等、位置各異的電泳條帶，說明不同區域相對穩定的微生物群落結構均有差異。電泳圖譜中存在共同的電泳譜帶，說明這些土壤之間可能存在一些共有的細菌類型。這些條帶的分布特征可以說明土壤中既有共同的微生物種類，也有自己獨特的微生物種屬，形成了各自特定生態位的群落結構[25]。一般來說，DGGE圖譜中的每一條帶就代表一種微生物物種，優勢微生物的條帶會明顯深一些。圖中顯示不同類型油茶人工林土壤細菌特征PCR-DGGE圖譜，各個泳道中條帶數量和亮度均存在差異。從指紋圖譜中可以看出，某些條帶為不同類型油茶人工林土壤所特有；供試土壤共有的條帶也會隨著油茶人工林種植年限的不同而呈現出漸弱或漸強。這說明在不同類型的油茶人工林土壤中，土壤細菌群落結構組成發生了改變。

圖 1 油茶人工林土壤基因組DNA提取Fig. 1 Soil microbial DNA extraction of different C. oleifera forests

圖 2 油茶人工林土壤微生物PCR擴增Fig. 2 Soil microbial PCR ampli fi cation of arti fi cial C. oleifera forests

根據DGGE圖譜分析（見圖4）后所得的條帶數進行Shannon多樣性指數分析。由圖4可知，不同種植年限、季節變化、管理方式下油茶人工林土壤細菌基因多樣性變化特征。從不同種植年限的比較來看，集約經營的1年齡、6年齡和10年齡油茶林土壤的細菌豐富度、香農多樣性指數呈現隨著種植年限的增長先減少后增加的變化趨勢；而粗放經營的10年齡、30年齡和50年齡油茶林則隨著種植年限的增長土壤的細菌豐富度、香農多樣性指數呈現先增加后減少的變化趨勢。

從豐富度和香農多樣性指數的季節變化來看，中齡林（D-10yr、E-10yr）和幼齡林（B-1yr、C-6yr）均呈現夏季高，冬季次之，秋、春季較低的變化趨勢，成熟林（F-30yr、G-50yr）呈現夏季高，秋、冬季次之，春季較低的變化趨勢。

圖 3 油茶人工林土壤細菌16S rDNA的DGGE圖譜Fig. 3 DGGE spectrum of soil bacterial 16S rDNA of arti fi cial C. oleifera forests

從2種經營管理方式的10年齡油茶人工林（D-10yr，E-10yr）對比來看，集約經營的10年齡油茶人工林（D-10yr）豐富度、香農多樣性指數春、夏季均顯著大于粗放經營10年齡油茶人工林（E-10yr）；且春、夏季豐富度均值依次提高8.33%，16.67%；春、夏季香農多樣性指數均值依次提高2.94%，5.11%；秋季差異不顯著。

圖 4 油茶人工林土壤細菌16S rDNA的DGGE圖譜泳道分析Fig. 4 Lane analysis of DGGE spectrum of soil bacterial 16S rDNA of arti fi cial C. oleifera forests

2.4 細菌16S rDNA片段的DGGE指紋圖譜的聚類分析

根據各條帶的相對遷移率和相對密度進行聚類分析（UPGMA），各供試土壤之間相似性系數的聚類分析結果見圖5。在6種類型的油茶人工林土壤中，細菌群落組成表現出較大的變異性，其各自的優勢條帶明顯，相似性為25%～70%，同時表現出明顯的季節變化，說明油茶人工林從幼齡林、中齡林至成熟林群落結構發生了顯著變化。

2.5 細菌16S rDNA的系統發育分析

圖 5 油茶人工林土壤細菌群落多樣性指數的聚類分析Fig. 5 Cluster analysis of soil bacteria community diversity index of arti fi cial C. oleifera forests

細菌16S rDNA已成為目前細菌系統分類研究中最常用的分子指標，測定16S rDNA部分序列可達到對分離細菌分子鑒定的目的[26-27]。本研究中將DGGE圖譜上的優勢條帶切割下來進行純化克隆測序，將分離菌株的16S rDNA序列與GenBank數據庫中核酸序列進行相似性比對，結果見表3。由表3可知，大多數序列與未培養細菌的同源性較高，所有序列與數據庫中16S rDNA序列的相似性在84%～99%。其中，腸桿菌屬Enterobacter ludwigii與泛菌屬Pantoeasp、未培養芽孢桿菌屬Uncultured Bacillussp等菌株的16S rDNA序列相似性高達97%～99%，優勢條帶所對應的序列登錄號見表3。

將所得序列及其相似序列進行遺傳關系研究，采用鄰接法構建系統發育樹狀圖（見圖6），得到優勢菌屬為泛菌屬Pantoeasp、腸桿菌Enterobacter ludwigii、菠蘿泛菌Pantoea ananatis。

3 討論與小結

（1）本研究結果是隨著種植年限的增長，油茶人工林土壤微生物群落基因多樣性指數的集約經營的1年齡、6年齡和10年齡呈現為隨著種植年限的增長先減少后增加的變化趨勢，而粗放經營的10年齡、30年齡和50年齡則隨著種植年限的增長呈現先增加后減少的變化趨勢。劉麗等[28]在研究不同發育階段杉木人工林對土壤微生物群落結構的影響中得出，杉木人工林土壤微生物群落多樣性指數隨著杉木人工林的生長發育而逐漸增加，這與本研究結果不完全一致。王雪山等[29]在研究種植年限對牡丹根際土壤微生物群落結構的影響中得出，土壤微生物群落結構多樣性水平隨種植年限的增加而降低，菌群結構趨于簡單，種類大量減少。其原因主要是隨著種植年限的增長，樹體每一生長發育階段的特性改變了土壤微域生境條件，為微生物的生長提供了豐富的碳源和氮源，引起土壤微生物群落結構的變化。

表 3 核苷酸序列同源性比對?Table 3 Homology comparison of nucleotide sequences

（2）本研究中，中齡林與成熟林、幼齡林呈現夏季高，春季較低的變化趨勢，這一結果和前人的研究結果[30-31]相似。Schmidt等[32]的研究表明，在1年之內土壤微生物群落演替的主要原因是土壤微生物利用的主要底物發生了季節性演替：碳聚合物或酚類（冬季）、蛋白質（春季）、根際沉積物（夏季）；這也說明在不同的森林生態系統中，由于各種生態因子復雜的綜合作用以及關鍵生態因子的主導地位的不同，土壤微生物群落季節動態變化存在著顯著差異。Petra Marschnera等[33]認為，土壤有機碳的含量和C/N比能夠顯著影響土壤細菌群落結構的變化。由此可知，季節變化影響土壤的微域生境，從而導致不同類型的土壤微生物群落結構的相似性或多樣性變化。

（3）土壤微生物多樣性的影響因素很多，如土壤營養狀況、質地、溫度、水分和通氣性等，一定的集約經營管理通過影響土壤含水量、溫度、通氣性、pH值及有機碳和氮的水平而影響土壤微生物多樣性。本研究中集約經營10年齡油茶人工林豐富度、香農多樣性指數在春季和夏季均顯著大于粗放經營10年齡油茶人工林，且依次提高12.50%和4.03%。集約經營10年齡油茶人工林的菌種數量多，且在油茶人工林土壤中的優勢地位較明顯。劉琛等[34]在圍墾海涂微生物群落和土壤酶特征研究中得出，圍墾利用后土壤質量優于未利用海涂，土壤微生物多樣性指數高，該結果與本研究有相似之處。這主要是因為一定的集約經營管理方式改變了土壤微生境條件，引起土壤微生物群落結構的變化，對土壤的微生物生態環境產生了影響，同時不同程度地提高群落中各物種分布的均勻度與異質性。集約經營管理改變了林內的光照、溫度等生境條件，減少了植物種內對養分和水分的競爭，增加了物種豐富度，改善了土壤質量，有利于改善微生物的繁育條件。由此可知，集約經營管理措施通過改善土壤質量，能提高油茶人工林土壤微生物豐富度，增加微生物活性。

圖 6 系統發育樹Fig. 6 Phylogenetic tree

（4）PCR-DGGE技術是一種免培養的方法，從土壤微生物基因組的角度研究其多樣性。有必要進一步從遺傳和基因表達水平上對土壤微生物生理生化特性、微生物群落結構及多樣性等相互作用進行研究，對于微生物哪些種屬在影響土壤肥力時起了主要作用，是否可以分離篩選出有益微生物并用于生產實踐，有必要加強以功能基因組為核心的土壤微生物分子生態研究。本研究中只對細菌基因多樣性進行了探索，下一步將對其它重要獨特生理特群（如真菌、放線菌以及古菌等）進行試驗，通過克隆測序鑒定出各自具體的種屬，以診斷和評價復雜微生物群落的種群結構。優勢條帶測序結果與GenBank數據庫序列進行Blast序列比對，可以確定油茶人工林土壤中的優勢菌屬。所有序列與16S rDNA序列的相似性在84%～99%，其中與泛菌屬Pantoeasp、腸桿菌屬Enterobactersp、未培養芽孢桿菌屬Uncultured Bacillussp等菌株的16S rDNA序列相似性高達97%～99%。

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Soil microbial community diversity of Camellia oleifera forest in western Jiangxi

GUO Chun-lan1, ZHANG Lu1, YE Su-qiong2, LEI Lei1, WU Nan-sheng1
(1.College of Landscape and Art, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, Jiangxi, China;2.Jiangxi Environmental Engineering Vocational College, Ganzhou 341000, Jiangxi, China)

In order to learn the characteristics of soil microbial community structure of Camellia oleifera forest, and to reveal the responding mechanism of variation characteristics of soil microbial community structure diversity of C.oleifera forest on the environmental factors of forest ages, seasons, and so on, and to provide a theoretical basis for reasonable operation and management of C. oleifera forest, taking 24 soil samples in C. oleifera forest at different ages at Yushui District of Xinyu City of western Jiangxi as research objects, soil bacterial community diversity of C. oleifera forest was analyzed by using PCR-DGGE technology. The results of DGGE fi ngerprint analysis showed that soil bacterial diversity of C. oleifera forest was relatively rich, and the number of bands of each sample was from 13 to 36. The soil bacterial genetic diversity of ten-year arti fi cial forest was the most abundant, and number of bacterial strains in ten-year forest through intensive operation was the most. Based on bacterial richness and Shannon-Wiener diversity index from high to low, the order was middle age forest (two 10-year forests), mature forest (30-year and 50-year forests), and young forest (1-year and 6-year forests). The two indexes showed a seasonal variation consistent, the values in summer were higher than those in autumn and winter, and the values were the lowest in spring. The results of phylogenetic analysis of bacterial 16S rDNA showed that, most sequences had high homology with uncultured bacteria, and the similarity of the 16S rDNA sequences was between 84%-99%. The results of genetic relationship analysis showed that, the dominant bacteria werePantoeasp andEnterobactersp.

Camellia oleiferaforest; soil microorganism; PCR-DGGE; bacterial community diversity

S606+.1；S794.4 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981(2015)01—0025—08

2014-10-03

江西省青年科學基金項目（20122BAB213018）；江西省研究生創新基金（YC2011-S058）；江西農業大學博士啟動基金；國家科技部“十一五”科技支撐項目（2009BADB1B05-03）；江西省科技創新“六個一”工程重大科技專項“江西省油茶產業升級關鍵技術研究與示范”（贛科發計字〔2009〕230號）。

郭春蘭，講師，博士。

吳南生，副教授。E-mail：362220279@qq.com

郭春蘭,張 露,葉素瓊,等.贛西油茶人工林土壤微生物群落多樣性研究[J].經濟林研究,2015,33(1)：25－32.

[本文編校：聞 麗]