紅星梨葉片不定梢誘導及增殖培養

蘇艷麗，田 鵬，魏聞東

（中國農業科學院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

紅星梨葉片不定梢誘導及增殖培養

蘇艷麗，田 鵬，魏聞東

（中國農業科學院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

為了找到紅星梨葉片離體培養的最佳條件，從取材時間、暗培養、植物生長調節物質、不同繼代次數等方面研究其對紅星梨葉片再生的影響。結果表明：外植體取4月初的莖段較好，選用繼代2次植株的葉片，細胞分裂素BA比TDZ效果好，生長素IBA比NAA效果好，暗培養30 d，適合葉片再生的培養基為NN69＋BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L，適合再生苗增殖的培養基為MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L。

紅星梨；葉片；再生

紅星梨Pyrus communiscv. Starkrimson系鄭州果樹研究所1988年由新西蘭引入國內的優秀全紅色西洋梨品種，果實葫蘆形，外觀鮮紅艷麗，風味獨特有香氣，肉質柔軟多汁，風味酸甜清香可口，目前國內生產與市場上數量較少，價格較高，出口前景看好。穩定高效的離體培養體系的建立是遺傳轉化的基礎，雖然國內有關梨離體快繁的報道較多，但有關紅星梨的組培研究尚未見報道。本文中主要研究了紅星梨葉片再生體系建立的幾個影響因子，旨在為紅星梨葉片高效離體再生體系建立和進一步紅星梨遺傳轉化體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以鄭州果樹研究所梨育種試驗圃里紅星梨的莖段為外植體進行無菌培養，繼代培養基為MS＋BA 0.6 mg/L＋IBA 0.4 mg/L＋GA 0.2 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.5 g/L，pH值調至5.8，取繼代30 d的試管苗頂端未展開葉片，垂直葉片中脈橫切3刀，遠軸面向下，接種在葉片不定梢誘導培養基上，進行葉片不定梢的誘導。

1.2 方 法

1.2.1 不同取材時間對葉片再生的影響

分別在3月中旬和4月初取紅星梨莖段進行組織培養，統計不同時期的莖段誘導出的繼代苗葉片的再生率。

1.2.2 不同細胞分裂素和暗培養時長對葉片再生的影響

分別暗培養20 d和暗培養30 d，以NN69為基本培養基，觀察不同細胞分裂素對葉片再生的影響，2個處理為：①BA 5.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；②TDZ 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L。

1.2.3 不同培養基對葉片再生的影響

以NN69為基本培養基，采用4種不同的激素組合來研究不同培養基對葉片再生的影響，4個處理分別為：①BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋AgNO34.5 mg/L＋CH 300 mg/L；②BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋CH 300 mg/L；③BA 5.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L；④BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L。

1.2.4 不同繼代次數對葉片再生的影響

分別取繼代1次、繼代2次和繼代4次的葉片進行再生培養，觀察不同繼代次數對葉片再生的影響。

1.2.5 不同細胞分裂素濃度對再生苗增殖的影響

以MS為基本培養基，生長素用IBA 0.2 mg/L，細胞分裂素BA設3個質量濃度處理：0.5、1.0、1.5 mg/L，赤霉素GA用0.2 mg/L，觀察不同細胞分裂素質量濃度下葉片的再生情況。

1.3 計算方法

再生頻率＝(再生不定芽葉塊數/接種葉塊數)×100%；

平均每葉再生不定芽數＝再生不定芽總數/再生不定芽的葉塊數；

增殖頻率＝(增殖的不定芽數/增殖前不定芽總數)×100%。

2 結果與分析

2.1 不同取材時間對葉片再生的影響

經調查，3月份取材接種的1批，葉片再生頻率為30.5%，平均每葉再生梢數為2.6；4月份取材接種的1批，葉片再生頻率為67.6%，平均每葉再生梢數為1.7。經方差分析，P＝0.000＜0.01，2次取材的再生頻率差異達極顯著，說明不同時期的外植體對葉片再生頻率的影響很大。

2.2 不同細胞分裂素及暗培養時長對葉片再生的影響

不同細胞分裂素和暗培養時長對葉片再生的影響見表1。從表1可得出，暗培養20 d時，處理1的葉片再生率為22.2%，較處理2的葉片再生率14.3%提高了55.2%，經T檢驗，P＝0.006＜0.05，差異達顯著水平；暗培養30 d時，處理1的葉片再生率為30.77%，較處理2的葉片再生率21.43%提高了43.6%，經T檢驗，P＝0.006＜0.05，差異達顯著水平。說明暗培養20 d與30 d，處理1的葉片再生率均比處理2高，且觀察發現處理1的葉片再生苗長勢也比處理2好，處理2的葉片再生苗有大團的白色愈傷，苗子簇狀，說明紅星梨葉片再生時選用細胞分裂素BA比TDZ效果好。

表 1 不同細胞分裂素和暗培養時長對葉片再生的影響Table 1 Effect of different cytokinins and dark culture duration on leaf regeneration

經方差分析，不同細胞分裂素和暗培養時長對紅星梨葉片再生率的影響均達極顯著水平，P＝0.000＜0.01。選用細胞分裂素BA時，暗培養20 d葉片再生率為22.2%，暗培養30 d葉片再生率為30.77%，再生率提高了38.6%，經T檢驗，P＝0.017＜0.05，差異達顯著水平；選用細胞分裂素TDZ時，暗培養20 d葉片再生率為14.3%，暗培養30 d葉片再生率為21.43%，再生率提高了49.9%，經T檢驗，P＝0.017＜0.05，差異達顯著水平。說明紅星梨葉片再生時，暗培養30 d比暗培養20 d效果好。

2.3 不同培養基對葉片再生的影響

不同培養基中葉片的再生率見表2。從表2可得出，處理1和處理2培養基中分別添加AgNO34.5 mg/L和CH 300 mg/L后，與處理3相比，葉片的再生頻率降低了，說明這2種物質對提高紅星梨葉片的再生頻率沒有作用。經方差分析，4種不同的培養基，其得到的葉片再生頻率間差異極顯著，P＝0.000＜0.01，說明不同生長素對紅星梨葉片的再生頻率影響較大，生長素用IBA比NAA效果好。

表 2 不同培養基的葉片再生率Table 2 Leaf regeneration frequencies in different media

2.4 不同繼代次數對葉片再生的影響

在NN69＋BA5.0mg/L＋IBA0.3mg/L培養基上，繼代1、2、4次葉片的再生率分別為33.3%、67.6%、3.7%?？梢钥闯觯^代2次的葉片再生率最高（見圖1），隨著繼代次數的增加葉片的再生率下降，因此葉片再生時最好選用繼代2次的葉片。

2.5 不同細胞分裂素濃度對再生苗增殖的影響

不同細胞分裂濃度下再生苗的增殖情況見表3。從表3可看出，隨著細胞分裂素BA質量濃度的提高，再生苗的增殖率呈先升高又降低的趨勢，BA 1.0 mg/L時增殖率最高，達75%（見圖2），經方差分析，各處理間增殖率的差異均達極顯著水平，P＝0.000＜0.01。選用BA1.0 mg/L時增殖的苗多、苗壯，表現最好，因此培養基MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L可作為紅星梨葉片再生苗的增殖培養基，觀察發現，用此培養基繼續轉接增殖，增殖效果越來越好，增殖系數可達3.96。

表 3 不同細胞分裂素濃度下再生苗的增殖情況Table 3 Proliferation status of regeneration seedlings under different concentrations of cytokinins

圖 2 葉片再生梢增殖Fig. 2 Proliferation of regenerated shoots from leaves

3 結論與討論

通過對取材時間、不同細胞分裂素和暗培養時長、不同添加物質、不同繼代次數等方面對紅星梨葉片再生的影響進行研究，得出紅星梨葉片再生可用4月初的莖段為外植體，選用繼代第2次植株中上部的葉片，葉片再生合適的培養基為NN69＋BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L，暗培養30 d；適合再生芽增殖的培養基為MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L，增殖系數可達3.96。

不同時期的外植體對葉片再生的影響顯著。進行紅星梨葉片再生培養時，用莖段作外植體，4月初的莖段較3月中旬的莖段繼代苗葉片再生率高。紅星梨繼代2次的葉片再生率最高，隨著繼代次數的增加葉片的再生率下降。湯紹虎等[1]對雪青梨的研究中也得出相同的結論。

培養環境也對葉片再生產生十分重要的影響。一般暗培養20～30 d有利葉片不定芽的再生[2-5]。本研究結果表明，不同暗培養時間對紅星梨葉片再生效果影響顯著，以暗培養30 d為最佳。

培養基中添加AgNO3能促進梨不定芽再生，但在不同的植物生長調節物質配比上，最適AgNO3濃度不同[5-7]。CH 100 mg/L[1]能夠明顯促進雪青梨不定梢的分化。本文中研究結果表明，培養基中添加AgNO34.5 mg/L和CH 300 mg/L對提高紅星梨葉片的再生頻率沒有作用，可能是添加的濃度不合適。

葉片的不定梢再生受多種因素的影響，基因型是最重要的影響因素，基本培養基影響不定梢能否再生，植物生長物質影響不定梢再生率，3個因素適當配合才能獲得最佳的再生效果[2]。已有研究表明[2,5,7-10]，在NN69基本培養基上能高效再生出不定芽，本試驗中紅星梨能在NN69基本培養基上再生出不定芽，但再生率不高，可能是沒有找到最佳的生長調節劑配比。關于BA、TDZ使用效果的比較，報道不盡一致[1-4,7,11-12]，本研究結果表明，紅星梨的葉片再生，細胞分裂素BA比TDZ再生效果好，生長素IBA比NAA效果好，與孫清榮等[2]認為基本培養基為NN69，細胞分裂素為BA時，NAA比IBA更有利于西洋梨葉片再生的結論不同。本研究中紅星梨的葉片再生率滿足不了進一步建立遺傳轉化體系的要求，細胞分裂素和生長素的最佳配比還有待繼續研究。

另外，再生葉片的選擇和處理[2,5,7,13]及不同的接種方式[2,5,13]對葉片再生率的影響也不同，采用展開的葉片或其它接種方式是否能提高紅星梨葉片再生率有待進一步研究。

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Induction and proliferation culture of adventitious shoots fromPyrus communisleaves

SU Yan-li, TIAN Peng, WEI Wen-dong
(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450009, Henan, China)

In order to find the best conditions of leaves in vitro culture, effects of sampling time, dark culture, plant growth regulators and subculture times on leaf regeneration inPyrus communiswere researched. The results showed that,the best explants were the stem segments in early April, it had best effect that leaves subcultured for two times were dark cultured for 30 days, BA had better effects than TDZ, and IBA had better effect than NAA. Suitable culture medium for leaf regeneration was NN69＋BA 5.0 mg/L＋IBA 0.3 mg/L, and suitable culture medium for regeneration seedling multiplication was MS＋BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋GA 0.2 mg/L.

Pyrus communis; leaf; regeneration

S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981(2015)01—0103—04

2014-06-18

河南省重點科技攻關項目（082102150011）；河南省重大科技攻關項目（092101110400）。

蘇艷麗，助理研究員，碩士。E-mail：suyanli@caas.cn

蘇艷麗,田 鵬,魏聞東.紅星梨葉片不定梢誘導及增殖培養[J].經濟林研究,2015,33(1)：103－106.

[本文編校：聞 麗]