復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿miRNA表達水平與臨床病理特征、化療療效及預后關系的研究

邵彬李惠平#朱軍邸立軍宋國紅姜晗昉梁旭王超穎嚴穎林曉琳王麗娜宛鳳玲袁艷華尤渺寧

北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所1乳腺腫瘤內(nèi)科，2淋巴腫瘤內(nèi)科，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京100142

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致患者死亡的主要原因[1]。當腫瘤局限在乳腺中時，其治愈率超過90%；而當癌細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移后，其5年生存率低于30%[2]。晚期乳腺癌的治療是以化療為主的綜合治療，而一線化療的有效率為30%～50%，二線化療的有效率則更低[3]。因此，如何提高化療的有效率是臨床治療成功的關鍵。隨著分子生物學及病理學的進展，化療相關預測及預后因子的研究已成為熱點。

microRNA（miRNA）是一類長度為20～24個核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。其主要功能是對編碼mRNA進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，其中大多數(shù)的miRNA可通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）的完全或不完全的互補結合而降解mRNA或抑制mRNA的表達，進而影響細胞的增殖、凋亡和分化。近年來，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以及與預后和藥物敏感性的研究均有一定的報道，這提示miRNA可能為腫瘤耐藥機制的研究提供了新的思路。自Lawire等[4]首次在人血清中分離出miRNA后，多項研究已經(jīng)證實：miRNA分子廣泛存在于血清和血漿中，并且隨著生理狀況、疾病的種類和病程的不同，miRNA分子在血清和血漿中存在的種類和表達水平將發(fā)生變化。且晚期乳腺癌患者組織標本獲取困難，這為血清或血漿miRNA作為疾病無創(chuàng)診斷和預后的分子標志物提供了可能[5-6]。

本研究擬通過檢測復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者各血漿 miRNA（包括血漿miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375、miR-451）的化療前、后的表達水平，探討血漿中miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375、miR-451化療前、后表達水平與乳腺癌臨床病理特征、化療療效及預后之間的關系，以為復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2009年6月至2013年12月在北京腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤內(nèi)科治療的79例復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，所有病例均經(jīng)術后組織或穿刺病理證實。美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）體能狀態(tài)評分為0～1分；患者中位年齡為54歲（30～81歲）；其中浸潤性導管癌有75例，浸潤性小葉癌有1例，其他類型有3例；免疫組化結果為雌激素受體（estrogen receptor，ER）呈陽性者有52例，呈陰性者為26例，1例不詳；孕激素受體（progestrogen receptor，PR）呈陽性者為45例，呈陰性者為33例，1例不詳；激素受體（hormone receptor，HR）陽性者（ER或PR有一項陽性或均為陽性）為57例，呈陰性者為21例，1例不詳；人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）呈陽性者為15例，呈陰性者為58例，6例不詳；手術時原位癌患者為1例，分期為Ⅰ期者為8例，Ⅱ期者為29例，Ⅲ期者為29例，Ⅳ期者為7例，另外有5例分期不詳；復發(fā)轉(zhuǎn)移患者均經(jīng)影像學證實；無內(nèi)臟轉(zhuǎn)移者為26例，有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移者為53例，其中肺轉(zhuǎn)移31例，肝轉(zhuǎn)移29例，骨轉(zhuǎn)移35例，淋巴轉(zhuǎn)移48例，胸壁復發(fā)18例，腦轉(zhuǎn)移3例，惡性胸腔積液17例，惡性心包積液7例，骨髓轉(zhuǎn)移1例，軟組織轉(zhuǎn)移1例，伴發(fā)宮頸癌1例。79例患者中2例患者化療線數(shù)不詳。本項目所有研究對象均簽署了關于在本研究中使用其血液樣本的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 患者的治療和評估 所 有患者接受兩藥聯(lián)合方案：多西他賽75 mg/m2+塞替哌75 mg/m2，d1，每3周為一個周期，共6個周期。分別在2個周期、4個周期及6個周期后（4、6個周期后仍常規(guī)影像學評效檢查，但未抽取血樣）評其療效。應用RESCIST標準評估患者對治療的反應：完全緩解（complete response，CR）為所有目標病灶完全消失；部分緩解（partial response，PR）為基線病灶長徑總和縮小≥30%；疾病進展（progressive disease，PD）為基線病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新的病灶；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）為基線病灶長徑總和縮小但未達PR或增加未達PD。ORR=CR+PR，臨床獲益率（clinical benefit rate，CBR）=CR+PR+SD（維持時間大于3個月）。無進展生存時間為復發(fā)轉(zhuǎn)移后化療第1天至疾病進展時間；總生存時間為化療第1天至患者死亡。

1.2..22血液標本的收集和制備 分別采集患者化療前及2個周期后評價時的外周血4 ml，放置于含肝素的抗凝管中。在采集后2 h內(nèi)將外周血以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，分離成血漿和細胞成分，血漿儲存在－80℃冰箱內(nèi)備用。

1.2..33 qRT-PCR -PCR檢測 應用PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自于日本Takara Bio Inc公司）直接對血漿標本進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。其中反轉(zhuǎn)錄混合反應液如下：5×PrimeScript緩沖液 4 μl；Prime-Script反轉(zhuǎn)錄混合酶Ⅰ1μl；miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375、miR-451反轉(zhuǎn)錄引物各2 μl；血漿10μl；加DEPC水至總體積20μl。在PCR擴增儀進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應條件為25℃10 min，42℃30min，85℃ 5 min；反應結束后，將合成的cDNA樣品用蒸餾水稀釋至100μl置于冰上待用或于－20℃下保存，然后進行Real-time PCR反應。miRNA反轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物均購自廣州銳博生物科技有限公司。應用ABI?900HT Fast型Real-Time PCR（購自美國Life technology公司）檢測系統(tǒng)。25 μl體系配制如下：miR-16、miR-34a、miR-200a、miR-375和miR-451正向和反向引物（10μM）各 1 μl；cDNA 產(chǎn)物1 μl；Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.2 μl；10×Real-time PCR緩沖液3 μl；dNTP（10 μM）0.3μl；加水至總體積為25μl。進行PCR反應時，95℃下持續(xù)2 min使雙鏈DNA預變性，95℃下持續(xù)15 s使之變性，60℃下持續(xù)1 min進行退火及延伸，以上為一個循環(huán)，共進行40個循環(huán)的擴增。設定統(tǒng)一的Ct閾值分析實驗結果，取3次實驗的平均值。由于血漿中缺乏有效的對照，本研究采用GenEx version6軟件、Normfinder軟件和Genorm軟件確定內(nèi)對照為miR-34a，且通過實驗發(fā)現(xiàn)該對照在血漿中表達穩(wěn)定。患者各血漿miRNA相對表達水平均采用公式2-ΔCt計算，其中ΔCt=Ct目標miRNA－Ct對照miRNA。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行分析，采用χ2檢 驗比較患者 miR-16、miR-200a、miR-375 和miR-451化療前表達水平的變化與臨床病理特征、化療療效的關系。采用χ2檢驗檢測患者各種臨床病理特征對臨床獲益的影響。采用多因素回歸分析方法分析單因素分析中對ORR有意義的因素。采用Kaplan-Meier分析和Cox多因素回歸分析檢測患者臨床病理特征及各血漿miRNA對于PFS及OS的影響。P值為雙向性檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 血漿miRNA化療前的表達水平與患者臨床病理特征之間的關系

根據(jù)患者各血漿miRNA中位表達水平分為高表達組和低表達組。血漿miR-16、miR-200a、miR-375和miR-451化療前的表達水平與患者臨床病理特征關系的分析結果顯示，化療前血漿miR-451的表達與患者ER或HR狀態(tài)顯著相關，miR-451高表達組的患者ER陽性率顯著高于低表達者，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.025），分別為78.9%和55.0%；miR-451高表達組的患者HR陽性率顯著高于低表達者，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.031），分別為84.2%和62.5%。

而其他血漿miRNA表達水平與其他臨床病理特征如患者年齡、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)及化療線數(shù)無顯著相關（表1）。

2.2 血漿miRNA化療前、后表達水平與患者化療療效及生存時間的關系

2 2..2.1血漿mi RNA化療前、后表達水平與患者化療療效的關系 血漿miR-16、miR-200a、miR-451高表達組的PR與低表達組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（分別為 P=0.001，P=0.034，P=0.008；表2）；血漿miR-200a化療后表達水平降低組的PR與升高組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.037，表3）。CBR（＋）患者中，血漿miR-200a及miR-451高表達組與低表達組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（均P=0.002，表2）。ORR（＋）患者中，血漿miR-16高表達組與低表達組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.03，表2）；血漿miR-200a化療后表達水平降低組與升高組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.01，表3）。而其他臨床病理特征如患者年齡、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、HR狀態(tài)、HER2狀態(tài)、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移個數(shù)、化療線數(shù)及血漿miR-375與化療療效、CBR、ORR均無顯著相關性（表4）。

進一步將單因素分析中有顯著影響的miRNA進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，無miRNA表達水平與患者PR、CBR具有顯著相關性（P＞0.05）。其中，miR-200a化療后表達水平變化與ORR顯著相關（P=0.032），miR-200a化療后表達升高者的ORR顯著高于降低者，分別為57.9%和29.3%。

表1 復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者各血漿miRNA化療前表達水平與患者臨床病理特征的關系（例）

2.2..2 2血漿mi RNA化療前、后表達水平與患者生存時間關系 miR-200a低表達組的PFS與高表達組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.038），分別為10.2個月和5.2個月（表2）；血漿miR-200a化療后表達水平升高組的PFS與降低組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.009），分別為10.3個月和5.2個月（表3）。miR-16、miR-375、miR-451表達水平及化療后變化對于患者PFS均無顯著影響（表2，表3）。進一步行Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-200a化療后變化顯著影響患者PFS（P=0.038，HR=2.016）。

miR-16、miR-200a、miR-375和miR-451表達水平及化療后變化對OS均無顯著影響（表2，表3）。而患者年齡、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移及化療線數(shù)均顯著影響患者OS（表4）。進一步行COX回歸分析患者化療線數(shù)顯著影響患者OS（P=0.046，HR=1.903）。

3 討論

自Lawrie等[4]首次發(fā)現(xiàn)人血清中含有miRNA后，Chen等[6]和Mitchell等[7]幾乎同時報道了人血漿或血清中存在著穩(wěn)定的miRNA。Zhu等[8]在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)癌組織與血清miRNA表達有顯著差異。李振鳳等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，miR-21和miR-222在乳腺癌患者血漿中的表達明顯升高，而miR-205在乳腺癌患者血漿中的表達明顯下降。且血漿miR-21的表達水平與ER和PR相關，血漿miR-222的表達水平則在不同的腫瘤分期中表現(xiàn)不同。Anfossi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-19a在轉(zhuǎn)移性炎性乳腺癌中呈顯著升高，還發(fā)現(xiàn)HER2陽性的炎性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，血清miR-19a高表達者PFS和OS顯著延長。

表2 復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者各血漿mi RNA表達水平與患者化療療效及生存時間的關系（例）

miRNA能夠被分泌到細胞外環(huán)境，并進入血液和其他體液中高穩(wěn)定性循環(huán)。這種循環(huán)miRNA因其標本易獲取，具有可多次取樣的優(yōu)點，所以得到了越來越多的研究者的關注。循環(huán)miRNA被包裹在外泌體（exosome）、微小體（microvesicle）或凋亡小體（apoptotic body）中，這些膜性結構對miRNA起到了有效的保護作用[11-12]。另外，血液中某些蛋白分子或脂質(zhì)與miRNA的結合會使其具有抵抗RNase的能力[13]。因此，循環(huán)miRNA可以穩(wěn)定存在。而miRNA是如何從組織細胞進入血液循環(huán)中，目前還不十分明了。據(jù)推測[14]，miRNA可能會像其他物質(zhì)一樣從破碎的組織細胞或調(diào)亡細胞中被動漏出，也可能是由有病變的組織和細胞主動分泌進入血液循環(huán)，而后者被認為是主要方式。據(jù)報道[15]，在多種病理狀態(tài)下血液或其他體液中的一些miRNA的表達水平呈顯著升高或降低。以上說明了循環(huán)miRNA在腫瘤的研究中可以作為很好的研究對象，可為腫瘤的研究提供新的方法和思路[16-19]。

循環(huán)miRNA的研究尚存在一些問題。既往的報道[20]表明循環(huán)miRNA表達水平的相關結果可重復性差，這種不一致性也說明了循環(huán)miRNA研究的困難性，由于各個研究采用的標本各異，檢測平臺的不同及內(nèi)參miRNA的差異均可能造成結果的差異。各研究中檢測的標本包括血漿、血清和全血，血漿和血清miRNA的含量相當，且血清的含量略高于血漿，而血清或血漿標本也同樣可能會受到血細胞miRNA（包括miR-16、miR-150、miR-486-5p、let-7a、miR-574-3p、miR-223、miR-197、miR-451和miR-92a）的影響[21]；全血標本則包含了更多血細胞miRNA。同時各個研究應用的miRNA芯片、第二代DNA測序、定量PCR方法的不同也可能會造成結果的差異。而內(nèi)參的選擇也是循環(huán)miRNA定量的困難點，各個研究中miRNA在循環(huán)中的不穩(wěn)定表達則造成了內(nèi)參的選擇各異。本研究中應用GenEx version 6軟件并運行Normfinder和Genorm軟件后發(fā)現(xiàn)，相對表達穩(wěn)定可作為內(nèi)對照的為miR-34a。miR-16在既往的多項研究中都作為內(nèi)對照，因此，本研究中也將其納入了檢測[22]。本研究中，miR-16在各個樣本中表達差異大，并不適合作內(nèi)參基因。且既往研究[23-25]表明，miR-16在白血病、垂體瘤、前列腺癌、肺癌及頭頸部腫瘤等多種腫瘤中存在異常表達，其調(diào)控的基因主要參與細胞周期的調(diào)控，包括Cyclin D1、Cyclin E、Bclˉ2等[26-28]。而本研究中，miR-16表達水平高低與化療療效顯著相關，miR-16低表達患者療效較好；但并未發(fā)現(xiàn)miR-16表達水平與臨床病理特征的關系。

表3 3發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者各血漿miRNA化療后表達水平變化與患者化療療效及生存時間的關系（例）

miR-451在正常胃黏膜中表達明顯高于在胃癌組織中的表達[29]。在頭頸部鱗癌中的研究[30]發(fā)現(xiàn)，miR-451在術后無復發(fā)的患者中表達較復發(fā)患者高。同樣，miR-451在低侵襲性的MCF-7乳腺癌細胞系的表達較MDB-231等高侵襲性細胞系中的表達高[31]。這些研究表明，miR-451在正常組織中發(fā)揮重要作用，而在病情進展時則出現(xiàn)表達水平下調(diào)。本研究中也發(fā)現(xiàn)miR-451高表達組的患者傾向于ER或HR表達陽性（p＜0.05），而既往細胞系的研究并未發(fā)現(xiàn)miR-451與ER具有調(diào)控關系[32]，由于本研究未進行下一步的細胞實驗，尚不能證明miR-451與ER是否存在調(diào)控關系。在各血漿miRNA化療前表達水平與患者化療療效的相關分析中發(fā)現(xiàn)，miR-451低表達組的PR與高表達組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.008），高表達組的CBR與低表達組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002），而ORR兩組無顯著差異。這可能與腫瘤惡性程度低，患者化療的CBR較高有關。Zhu等[33]的研究也證明了這一點，miR-451在多藥耐藥細胞系A2780DX5和KB-V1較敏感細胞系A2780和KB-3-1中顯著上調(diào)，而拮抗miR-451后P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白MDR1顯著下降，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。

目前的研究[34]表明，miRNA在乳腺癌耐藥及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。癌細胞在上皮間質(zhì)化過程中獲得了間質(zhì)特性，容易從原位腫瘤中遷移，從而導致腫瘤浸潤和遠處轉(zhuǎn)移[35]。在乳腺癌中，EMT與乳腺癌干細胞、三陰表型及基底樣細胞緊密相關，也與TGF-β1、Wnt和Notch信號通路相關，并且與Snail、Slug、Twist和ZEB1/2等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控相關[36]。miR-375在EMT中的作用尚不十分明確，Ward等[37]研究發(fā)現(xiàn)他莫西芬耐藥的MCF-7細胞系中過表達miR-375可以使細胞系重新獲得上皮樣特征，這表明miR-375在EMT中具有重要作用。本研究也未發(fā)現(xiàn)miR-375表達水平與化療療效及生存時間具有相關性。

miR-200家族包括 miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141，這5個成員分為2個組群，分別位于1號及12號染色體上。miR-200家族參與EMT的調(diào)控，乳腺癌細胞系中的相關研究表明，miR-200可通過下調(diào)ZEB1和ZEDB2以抑制鈣黏附蛋白 E（E-cadherin）的轉(zhuǎn)錄[38-39]。miR-200c在乳腺癌干細胞中通過抑制BMI-1的表達，從而抑制干細胞的自我更新，并造成乳腺癌干細胞體外擴增的下降。Hu等[40]報道卵巢癌miR-200a高表達患者會出現(xiàn)預后不良，且高表達者的中位生存時間顯著短于低表達者的，分別為27.5個月和61個月。而在乳腺癌的相關研究[41]中發(fā)現(xiàn)，miR-200a與患者淋巴結及遠處轉(zhuǎn)移相關，是影響預后的重要因素。而化生性乳腺癌患者，miR-200a高表達患者，表型為三陰性的患者及HER2陽性乳腺癌患者較ER陽性患者表達明顯降低，這些均表明miR-200家族與EMT及乳腺癌亞型相關[42]。EMT與腫瘤細胞耐藥性的獲得密切相關，EMT可以被抗腫瘤藥物、放療或低氧條件誘導發(fā)生，間質(zhì)表型的腫瘤細胞比上皮表型的腫瘤細胞更容易獲得耐藥性。本研究中發(fā)現(xiàn)血漿miR-200a化療后表達水平降低組的PR與升高組相比，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.034），而且化療后表達變化同樣會顯著影響患者的化療療效（P=0.037），化療后表達升高組ORR顯著高于降低組（P=0.01）。而進一步多因素分析發(fā)現(xiàn)，miR-200a化療后升高患者ORR仍顯著高于降低者（P=0.032）。在生存時間的分析中發(fā)現(xiàn)，miR-200a化療前低表達組PFS較高表達組顯著延長（P=0.038），分別為10.2個月和5.2個月。miR-200a化療后表達變化顯著影響患者PFS（P=0.009），化療后表達升高組PFS和降低組分別為10.3個月和5.2個月。化療后miR-200a表達升高者可能與化療后間質(zhì)性質(zhì)的癌細胞死亡相關，從而出現(xiàn)很好的療效及生存獲益率。

表4 復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床病理特征與患者化療療效及生存時間的相關性的P P值

綜上所述，復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌血漿miRNA化療前、后表達水平對復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床病理特征、化療療效及預后有一定預測價值。本實驗提示血漿中的miRNA可能為復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的診斷和治療開辟了一類新的血液腫瘤標志物，有助于判斷復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌臨床病理特征、療效及預后，更加準確的結果還需進一步擴大樣本量及進行前瞻性的研究來證實。

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