擬南芥 CDR6基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及過(guò)量表達(dá)植株篩選鑒定

董萬(wàn)春，樊婷婷，陽(yáng)立波，江海坤，張其安，方 凌，倪嬌嬌，管靈霞，曹樹(shù)青

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009;2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，安徽合肥230009)

擬南芥CDR6基因cDNA全長(zhǎng)1 120 bp，編碼一種含有NC結(jié)構(gòu)域的功能未知蛋白［1－3］，目前對(duì)其生物學(xué)功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)功能缺失型突變體篩選，獲得cdr6－1突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體種子具有耐鉛的特性，后來(lái)經(jīng)過(guò)PCR克隆出CDR6基因。為進(jìn)一步研究該基因的功能，筆者構(gòu)建了35S┊CDR6過(guò)量表達(dá)載體，然后利用基因工程技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因、篩選、鑒定，獲得了過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步揭示擬南芥對(duì)重金屬耐受的分子機(jī)理［4－5］奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。哥倫比亞野生型擬南芥WT，購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心，由合肥工業(yè)大學(xué)生物與與食品工程學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行繁衍保存。

1.1.2 主要試劑。EazyTaq DNA Polymerase(TransGen)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa);TIANGel MiDi Purification Kit、T4DNA 連接酶、TIANprep MiniPlasmid kit、TIANquick MiDi Purification Kit(TIANGEN 公司);XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。

1.1.3 宿主菌和載體。平末端載體感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、農(nóng)桿菌GV3101、pXB094載體(改造后帶有35S強(qiáng)啟動(dòng)子和NOS轉(zhuǎn)錄終止子)。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥平板培養(yǎng)。用25%次氯酸鈉浸洗種子2 min，再用無(wú)菌水洗滌4～5次，將種子轉(zhuǎn)移到濾紙上晾干后，播于1/2MS固體培養(yǎng)基中，置于4℃冰箱春化3 d后置于培養(yǎng)室［培養(yǎng)條件為溫度23℃、光照強(qiáng)度100 μmol/(m2· s)、光照時(shí)間18 h/d］培養(yǎng)14 d。

1.2.2 擬南芥植株總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將研缽洗凈，于干燥箱中高溫殺菌3 h，然后冷卻至室溫。取約100 mg擬南芥材料置于研缽中，加入液氮將植株磨碎后，加入1 ml Trizol裂解液，繼續(xù)研磨至材料融化，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管;然后向其中加入200 μl氯仿(預(yù)冷)，強(qiáng)烈振蕩15 s，室溫靜置5 min，然后于4℃、12 000 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，向其中加入500 μl異丙醇(預(yù)冷)，顛倒混勻，室溫靜置10 min，然后于 4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入1 ml 75%乙醇(750 μl無(wú)水乙醇+250 μl DEPC處理水)，溫和顛倒離心管，然后于4℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫晾曬5～10 min，讓乙醇揮發(fā)完全，最后向離心管中加入30～50 μl DEPC處理水溶解RNA(可于58℃水浴10 min);檢測(cè)其濃度及含量。為防止降解，立即將RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。

1.2.3 CDR6基因擴(kuò)增。用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)引物:正向引物FP1:NNNCTCGAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA;反向引物RP1:NNNAAGCTTACTCGTGCTTGGTAAAGCTATG。鑒定陽(yáng)性植株所用PCR擴(kuò)增引物為:正向引物FP2:NNNCTC-GAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA;反向引物RP2:GAACTTCAGGGTCAGCTTGC。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4 酶切、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序。用限制性內(nèi)切酶XhoI和HindIII同時(shí)酶切CDR6基因片段與載體pXB094，并回收純化。用T4連接酶連接酶切片段，并將其轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)，用含有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的克隆接種于含壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒并電泳檢測(cè)，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 浸花法侵染擬南芥植株。將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證無(wú)誤的陽(yáng)性克隆接種于含壯觀霉素和慶大霉素的LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600為1.2左右;將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清;用滲透緩沖液(1/2 MS培養(yǎng)基+5%蔗糖)重懸至OD600=0.8～1.0，加入終濃度為0.03%Silwet－L77，混勻;事先將待侵染植株的果莢去除，用滲透緩沖液侵染花序10～15 s，侵染完成后，將植株用保鮮膜包裹好，放入紙箱避光培養(yǎng)24 h后取下保鮮膜，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDR6基因的克隆 以cDNA為模板擴(kuò)增CDR6基因，將PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1a。CDR6基因CDS序列長(zhǎng)780 bp，條帶大小與目的片段大小一致，說(shuō)明成功克隆出CDR6基因。另外對(duì)pXB094質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1b。

2.2 CDR6基因過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶XhoI和HindIII同時(shí)對(duì)基因CDR6和pXB094載體進(jìn)行雙酶切，切膠回收后，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。用含壯觀霉素的LB平板篩選陽(yáng)性單克隆，菌落PCR驗(yàn)證，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，擴(kuò)增出的條帶大小正確。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列100%比對(duì)，說(shuō)明CDR6過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建完成。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選 植株侵染后，收取T0代種子。用含有卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選種子，篩選結(jié)果見(jiàn)圖4，箭頭所指幼苗很綠可以存活的為陽(yáng)性株，將其移栽至土壤中進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)大后，提取野生型和轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR鑒定。所用引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物總長(zhǎng)度為1 000 bp左右，對(duì)照植株無(wú)條帶，陽(yáng)性植株有條帶(圖5中1～8號(hào)株系)，說(shuō)明鑒定出的轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。

3 結(jié)論與討論

重金屬造成的土壤和水源污染已對(duì)全球的食品安全、人類身體健康、生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前已克隆出一些植物抗重金屬基因并對(duì)其抗逆機(jī)理進(jìn)行了深入研究，這種將外源抗逆基因?qū)胫参锘蚪M的基因工程技術(shù)，在提高植物抗逆性、改良植物遺傳性狀及改善土壤重金屬污染問(wèn)題等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［7－9］。前期研究結(jié)果顯示，功能缺失型突變體cdr6-1在鉛脅迫下與WT相比表現(xiàn)出更為耐受的特性，另外CDR6基因還會(huì)被鉛誘導(dǎo)表達(dá)。這表明CDR6基因可能會(huì)參與鉛脅迫響應(yīng)。CDR6基因過(guò)量表達(dá)植株的獲得將有利于研究植物對(duì)重金屬的響應(yīng)機(jī)制，為改善土壤重金屬污染提供理論依據(jù)［10］。

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