BolSDG8 RNA干擾載體構建和擬南芥的遺傳轉化

常 誠，姜 玲，阮 穎 (湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128)

開花是植物生長發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，植物的花期對于植物維持正常的生命周期具有重要意義。研究表明，植物開花至少受到5條主要途徑調(diào)控:光周期途徑、春化作用途徑、GA途徑、自主途徑和表觀遺傳調(diào)控途徑。組蛋白甲基化修飾作為重要的表觀遺傳調(diào)控方式，積極參與到植物開花調(diào)控網(wǎng)絡中。擬南芥SDG8(SET DOMAIN GROUP 8)編碼的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶是酵母SET2的同源物［1－2］，包含約1 806個氨基酸序列，其中含一個CW(cysteine and tryptophan conserved)結構域、一個AWS(Associated With SET)結構域、一個SET結構域和一個Post SET結構域［3］，能特異性地催化組蛋白H3第36位賴氨酸(H3K36)發(fā)生雙、三甲基化修飾。功能缺失的擬南芥sdg8突變體，其植株表現(xiàn)為弱小、早花，而究其早花原因，是由于其H3K36的雙、三甲基化水平顯著降低，開花關鍵基因FLC轉錄受到抑制，進而使植株表現(xiàn)為早花。因此，擬南芥SDG8介導的H3K36甲基化在抑制植物早花過程中起著重要作用。

甘藍BolSDG8是擬南芥SDG8的同源基因。生物信息學分析表明，BolSDG8全長cDNA為5 088 bp，編碼1 696個氨基酸，與擬南芥SDG8氨基酸序列的同源性達到87%，也包含一個CW結構域、一個AWS結構域、一個SET結構域和一個Post SET結構域。因此，筆者通過構建BolSDG8 RNA干擾載體和浸花法轉化至野生型擬南芥(Col-0)，檢測來自甘藍BolSDG8基因的片段能否有效沉默擬南芥SDG8的功能［4］，進而研究甘藍BolSDG8與擬南芥SDG8在調(diào)控植物開花上是否具有相似的生物學功能，為深入研究BolSDG8的功能奠定基礎，同時為培育適當早花早熟的甘藍型油菜品種［5］提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 材料 擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col-0和突變體sdg8-2;大腸桿菌(E．coli)DH5α;根癌農(nóng)桿菌GV3101;載體pMD-19 T vector和pFGC5941，均由湖南農(nóng)業(yè)大學植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實驗室提供。

1．2 方法

1．2．1 甘藍BolSDG8-RNAi的克隆。通過比對擬南芥SDG8與甘藍BolSDG8cDNA序列，選擇一段約359 bp的保守序列，命名為BolSDG8-RNAi，設計引物序列:BolSDG8-RNAi F:5'-GGCGCGCCGGATCCAAGATTCCTTCCCCACTTTCGTCAT-3'(AscI/BamHI)BolSDG8-RNAi R，5'-CCATGGTCTAGATTCATGACACTGAATGGGAATGAGG-3'(NcoI/XbaI)。

采用高保真酶PCR擴增后，獲得目的片段。對其回收并連接至pMDl9-T載體，命名為pMDl9-T-BolSDG8-RNAi，經(jīng)熱激法轉化至大腸桿菌DH5α中，挑選陽性單菌落送至公司測序。

1．2．2 RNAi干擾載體的構建。首先使用BamH I和Xba I雙酶切載體pMDl9-T-BolSDG8-RNAi和pFGC5941(圖1)，將BolSDG8-RNAi反向插至查爾酮內(nèi)含子與終止子之間，獲得載體p-BolSDG8-RNAi;然后使用Asc I和Nco I雙酶切載體pMDl9-T-BolSDG8-l和p-BolSDG8-RNAi，將目的片段正向插至35 S啟動子與查爾酮內(nèi)含子之間，獲得干擾載體pFGC5941-BolSDG8-RNAi。

1．2．3 擬南芥的遺傳轉化。將pFGC5941-BolSDG8-RNAi轉至農(nóng)桿菌GV3101中，挑選陽性克隆用于擬南芥的遺傳轉化。采用浸花法［3］將該質(zhì)粒轉至野生型擬南芥(Col-0)，采用濃度30 mg/ml PPT噴施擬南芥幼苗進行篩選，對獲得的抗性苗使用如下引物進行PCR檢測，確認是否為轉基因植株。

35S825 F:5'-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT-3';Intron825 R:5'-TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3'。

1．2．4 轉基因植株的表型觀察與生物學統(tǒng)計。對生長于長日照條件下(16h/8h)的野生型擬南芥Col-0、突變體sdg8-2和轉基因植株分別進行開花天數(shù)和抽薹時蓮座葉數(shù)目的統(tǒng)計，并拍照。

2 結果與分析

2．1 BolSDG8-RNAi的克隆 通過比對，選擇一段359 bp的保守序列作為RNAi干擾片段(圖2)，克隆到BolSDG8-RNAi目的片段，并將其連接至pMDl9-T載體上，經(jīng)熱激法轉至大腸桿菌DH5α中，挑選陽性單菌落送至公司測序，經(jīng)比對，目的片段與預期片段大小完全一致(圖3)。

2．2 BolSDG8干擾載體構建 根據(jù)圖1所示，將BolSDG8-RNAi正反插至pFGC5941載體上，經(jīng)酶切驗證，BolSDG8干擾載體pFGC5941-BolSDG8-RNAi構建成功，酶切后的片段大小與預期相符(圖4)。

2．3 擬南芥的遺傳轉化 通過浸花法和PPT抗性篩選［6］，獲得抗性苗(圖5)。通過改良的CTAB法提取抗性苗總DNA，并進行分子檢測，結果顯示，抗性苗為轉基因植株(圖6)。轉化共計42株，分株收取種子。經(jīng)檢測共計3株完成轉化，將轉化苗命名為BolSDG8RNAi。

2．4 BolSDG8RNAi轉基因植株表型 在長日照條件下，觀察生長35 d的T3代BolSDG8RNAi轉基因擬南芥植株，與Col-0相比，BolSDG8RNAi轉基因植株長勢弱小，明顯早花，其整體生物學表型與sdg8-2突變體相似(圖7)。由圖8可知，無論是蓮座葉數(shù)目還是開花天數(shù)，BolSDG8RNAi轉基因植株明顯少于 Col-0，接近于 sdg8-2，這進一步證實了 BolSDG8RNAi轉基因植株具有與擬南芥sdg8-2突變體相似的早花表型。

3 討論

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學標記［7］，也是參與開花調(diào)控的重要途徑之一［8］。其主要通過改 變?nèi)旧|(zhì)結構來影響基因的轉錄表達，使其在植物生長發(fā)育過程中起到了重要作用［9］。組蛋白賴氨酸甲基化修飾是通過特異的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶催化實現(xiàn)的［10］。組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(histonelysine methyltransferase，HLMT)是一類含有SET結構域的蛋白［11］，進化上保守的SET結構域包含約130個氨基酸序列，形成一個結狀結構的酶催化中心。AtSDG8是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶，能特異性地催化組蛋白H3K36發(fā)生雙、三甲基化，導致開花關鍵基因FLC表達水平下降，從而使植物早花［12］。

AtSDG8以130多個堿基對形成一個節(jié)狀的酶催化中心［13］，即組蛋白甲基化轉移酶，該轉移酶通過催化組蛋白的甲基化來影響整個組蛋白結構，從而達到調(diào)控基因表達的目的［14］。

在開花天數(shù)上，sdg8相對于野生型Col開花時期更早，BolSDG8RNAi相對sdg8較晚，但明顯早于Col，兩者相對于Col都有明顯的早花現(xiàn)象。在蓮座葉數(shù)目上，BolSDG8RNAi更接近于sdg8，兩者相對于Col在蓮座葉數(shù)目上都較少。該試驗結果基本符合試驗預期，證明Bolsdg8與sdg8不但具有高度相似的序列和結構，在調(diào)控開花的生理功能上也十分類似。

甘藍型油菜是甘藍與白菜雜交后自然加倍而成的異源四倍體，具有來源于甘藍的一對染色體，通過甘藍早花基因BolSDG8的研究，將為進一步研究甘藍型油菜開花機制，以及為選育適當早花早熟的甘藍型油菜新品種來適應“稻稻油”耕作制度提供理論參考。

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