在人轉錄調控網絡中識別組織特異性功能模塊

胡躍兵，李彭平(．南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院神經外科，江蘇南京 000;．南京大學生命科學院，江蘇南京 003)

基因表達是調控子共同作用使特定的mRNA維持在穩(wěn)定水平的過程。其中一類調控子是轉錄因子，它通過結合在其調控基因的啟動子區(qū)，促進或抑制該基因的轉錄。它在調控細胞生長和凋亡中起到重要作用。很多轉錄因子還可作為疾病治療的靶標［1］。而microRNA(miRNA)則是通過抑制mRNA表達或促進mRNA降解，在轉錄后水平調解基因的表達［2］。由此，轉錄因子和miRNA分別通過在轉錄水平和轉錄后水平調控基因表達，從而在影響基因功能過程中發(fā)揮重要作用。而轉錄因子本身的表達在其轉錄后水平也受到miRNA的調控，而miRNA自身的轉錄也要接受轉錄因子的調控。因此，細胞內基因的表達系統實際上是由轉錄因子、miRNA以及它們靶基因之間組成的一個復雜的調控網絡。許多研究表明，特定生物學功能的實現是由一個包含多種相似功能分子的功能模塊完成的。模塊內部分子功能的相似度高于模塊之間分子功能的相似度，并且分子在模塊內的連接度遠遠高于模塊間分子之間的連接度［3］。轉錄調控模塊是由不同調控子調控特定靶基因集或同一類調控子調控不同靶基因集而形成的一個調控子網，是多個基因及其產物之間相互作用形成轉錄模塊的結果［4］。研究轉錄調控網絡模塊結構有利于進一步了解細胞的轉錄調控、細胞分化及其功能。

組織特異性基因的表達在組織的發(fā)育、細胞類型、功能和轉錄調控中起到重要作用［5］。在已經識別的miRNA中，有很多表現出了組織特異性或發(fā)育階段特異性的表達模式，并維持組織的特點和功能［6］。并且由轉錄因子形成的調控網絡會控制組織特異性基因的表達。組織特異性的轉錄因子和miRNA對于組織特異性的調控和功能極其重要。基因轉錄表達過程實際上是調控子和靶基因之間形成功能模塊作用的結果。由單個基因的組織特異性的表達調控的研究上升到模塊的組織特異性調控模式的挖掘，可以進一步加深對基因組織特異性轉錄調控和組織功能的理解。為此，筆者從人體的7個組織調控網絡出發(fā)，通過MCODE算法獲得各個組織的調控模塊，再通過計算模塊間共有的節(jié)點數目獲得組織間相似的模塊或組織特異性模塊，從而獲得組織特異性的調控模式。

1 數據來源與方法

1．1 各組織表達譜數據來源 從UniGene［7］和 CGAP［8］獲取人體的大腦、心臟、腎臟、肝臟、卵巢、脾和睪丸7個組織的蛋白質編碼基因(包括TF和non-TF)的表達譜數據，而miRNA的表達譜數據則取自Landgraf等［6］的研究。

1．2 網絡構建 通過以下方式構建包括人體大腦、心臟、腎臟、肝臟、卵巢、脾和睪丸7個組織的轉錄調控網絡(TRN):首先在人基因組范圍內預測TF、miRNA以及非蛋白質編碼基因之間的調控關系，獲得人的參考網絡，然后通過對應組織的表達譜數據得到在7個組織中表達的基因，并從參考網絡中獲取這些基因之間的調控關系從而構建各個組織網絡。在參考網絡中，TF與靶基因之間的調控關系是先通過TRANSFAC數據庫［9］找到靶基因上游1 kb的序列，之后在該段序列內尋找TF的靶點，該研究選取的是5個物種(人、狗、牛、小鼠和負鼠)保守的結果。而miRNA與靶基因之間的調控關系是通過取 Targetscan［10］、Pictar［11］和 Tarbase［12］3個預測結果的交集得到。

1．3 組織模塊挖掘 生物網絡可以直觀地看成一個圖形，圖形節(jié)點和邊分別表示生物分子和分子之間的關系。對于轉錄調控，則可以理解為一個有向的信號傳遞流，用有向圖表示。一般從圖中尋找子簇或局部緊密連接區(qū)域主要是依賴于網絡流最小割理論或譜聚類。MCODE［13］是用節(jié)點聚類系數大小作為節(jié)點權重的衡量，從網絡中獲取分子復合體的模塊挖掘方法。該算法主要分為節(jié)點權重計算、復合體預測、通過一定規(guī)則對復合體增加或減少節(jié)點3個階段。MCODE在挖掘模塊時會給每個模塊計算一個得分并按照該得分對模塊進行排序。模塊得分越高，則排位越靠前，該模塊內部連接也更加緊密。

1．4 模塊相似性得分 用公式(1)計算模塊相似性，式中N1、N2分別表示模塊1和模塊2的節(jié)點數，C表示2個模塊共有節(jié)點個數。當2個模塊節(jié)點大小和類型完全相同時，R等于1，表示2個模塊完全相同。當2個模塊之間的節(jié)點都不同時，共有節(jié)點數目C為0，此時R等于0。當R越接近1時，模塊越相似。

得到模塊相似得分后，以該得分作為模塊間的距離，對模塊進行系統聚類。聚類到一起的模塊就是組織間相似的模塊，而單個成簇的模塊就是組織特異性模塊。

2 結果與分析

2．1 組織模塊 通過MCODE算法對人體7個組織的調控網絡進行挖掘，得到大腦、心臟、腎臟、肝臟、卵巢、脾和睪丸的模塊數目分別是 20、11、15、12、16、16 和 15(表 1)。得到模塊后，統計模塊中調控子的組成情況，發(fā)現所有組織大部分模塊的調控子都包含轉錄因子和miRNA，只有少數模塊里面的調控子只是轉錄因子或miRNA(表2)，說明模塊的作用模式主要是轉錄因子和miRNA協同調控，這與前人的研究結果“轉錄因子和miRNA在乳腺癌和前列腺癌中共同調控基因的表達”［14］是一致的。

表1 網絡邊的大小和模塊數目

表2 模塊的作用模式

計算每2個組織每2個模塊之間的相似性得分。例如，計算大腦和心臟模塊的相似性，則將大腦20個模塊分別和心臟的11個模塊一一進行計算。之后將組織相似性得分作為距離，對模塊進行系統聚類。105個模塊共聚為40類(圖1)。其中，卵巢的第14個模塊、腎臟的第14和第15個模塊、心臟的第10個模塊都各自聚類成一個簇，說明該4個模塊和其他模塊相似性很低，因此將其定義為組織特異性模塊。

2．2 腎臟組織特異性模塊 腎臟的第15個模塊(圖2)包含調控子 MTF1、hsa-miR-651、hsa-miR-708以及靶基因RAP1B和MTMR3。在該模塊中，hsa-miR-651和 hsa-miR-708共同調控RAP1B和MTMR3的表達，同時hsa-miR-651又調控轉錄因子MTF1的表達。RAP1B是RAS-like小GTP結合蛋白超家族成員之一，其主要功能是調控細胞粘附、生長、分化、遷移增殖以及整合素介導的細胞信號轉導［15］。有研究表明由RAP1B參與的cAMP/Rap1B/B-Raf通路可以調控結節(jié)性硬化癥腎細胞癌p27的表達和p27-cyclin D1的細胞質的錯誤定位，從而影響腎細胞癌的發(fā)生和癌癥的預后［16］。KEGG通路分析顯示，RAP1家族與腎細胞癌通路密切相關［17］。RAP1家族主要通過細胞粘附、增殖和遷移而參與到腎細胞癌通路中(圖3)。Hsa-miR-708被發(fā)現在腎細胞癌中能夠誘導細胞凋亡并抑制腫瘤生長，是腎細胞癌中非常重要的腫瘤抑制子［18］。MTF1是一種核質穿梭作為轉錄因子，聚集在細胞核內并結合到含有金屬反應元件(MRE)啟動子上，主要是誘導金屬硫蛋白及其他維持金屬穩(wěn)態(tài)相關蛋白的表達。而金屬硫蛋白主要功能是抵抗重金屬、清除自由基，許多研究表明其表達異常與腫瘤密切相關，已經作為結腸直腸癌和前列腺癌診斷的分子標記物［19］。綜上所述，RAP1B和has-miR-708都與癌癥密切相關，根據模塊中分子功能相似性特點推測 hsa-miR-651可能是和has-miR-708協同調控RAP1B和MTMR3的表達。而has-miR-651又調控轉錄因子MTF1的表達，該轉錄因子又進一步作用于金屬硫蛋白等相關蛋白，這些轉錄因子和miRNA形成的調控通路可能在腎細胞癌的形成發(fā)展中起重要作用。該模塊中的節(jié)點及其調控關系需要通過試驗進一步證實。

2．3 心臟組織特異性模塊 心臟的第10個模塊由GSK3B、CPEB3、hsa-miR-196b和轉錄因子HAND1組成(圖4)，在系統聚類中獨自成簇，是心臟的一個組織特異性模塊。HAND1是心臟特異性轉錄因子，主要功能是參與血管生成、發(fā)育以及肌肉組織形成。并且在心室隔和心臟形態(tài)學形成中也起著重要作用。HAND1和其另外一個家族成員以互補的方式工作，調節(jié)右心室和主動脈弓動脈的形成，提示HAND1和其家族成員可能會介導為先天性心臟病。Hatemi等研究表明HAND1序列的變異在心房異構的發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用［20］。而在先天性心臟病中也發(fā)現HAND1等基因的拷貝數變異，這些變異可能與心臟功能缺陷緊密相關［21］。

GSK3B是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，屬于糖原合酶激酶亞家族，是為數不多的信號分子，調節(jié)關鍵的細胞內信號轉導通路。在大鼠的胚胎發(fā)育過程中，GSK3B的缺失會導致胚胎干細胞中受損的心肌細胞的分化并促使心肌細胞顯著增生，從而使心室被心肌細胞填充［22］。研究表明，GSK3B是調節(jié)心肌纖維化的重要調控子，心臟成纖維細胞中GSK-3β特異性缺失會導致心臟纖維化、左心室功能障礙和在缺血性心臟中產生過多的疤痕［23］。

Hsa-miR-196b主要功能是參與粒細胞生成、脂質代謝和造血功能［24］。而粒細胞升高會導致心內膜炎和心肌病。CPEB3、hsa-miR-196b可能也與心室隔形成、心肌細胞功能相關。具體作用機制可能是hsa-miR-196b作用于轉錄因子HAND1，HAND1再作用于GSK3B，該調控通路在心室隔的形成、維持心肌細胞正常功能中發(fā)揮重要作用，需要通過試驗進一步證實。

3 結論

通過構建人體7個組織的調控網絡，并對各調控網絡進行模塊挖掘與比較分析，得到了與腎癌密切相關的腎臟特異性功能模塊，以及和室間隔的形成有關并參與心肌細胞功能的心臟特異性模塊。這些模塊中的基因以及基因之間的調控關系對于相應組織疾病的治療可能有重要作用。

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