基于HPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)的女性首發(fā)精神分裂癥機(jī)制研究

喬 穎 李華芳上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心 上海 200030

· 論著 ·

基于HPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)的女性首發(fā)精神分裂癥機(jī)制研究

喬 穎 李華芳△
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心 上海 200030

目的 采用基于HPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究女性首發(fā)精神分裂癥患者血漿樣品，鑒別精神分裂癥患者血漿代謝產(chǎn)物變化及標(biāo)志性代謝產(chǎn)物。 方法 以符合DSM-Ⅳ首發(fā)精神分裂癥的女性急性期住院患者為病例組，女性健康志愿者為對(duì)照組，取2組患者血漿并進(jìn)行基于HPLC-MS的代謝組學(xué)分析，尋找女性首發(fā)精神分裂癥的生物標(biāo)志物。 結(jié)果 與健康對(duì)照組相比，女性首發(fā)精神分裂癥患者血漿代謝物產(chǎn)生明顯變化，發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異性的代謝產(chǎn)物。 結(jié)論 基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)女性首發(fā)精神分裂癥患者存在氨基酸、能量及維生素E代謝紊亂。

精神分裂癥；代謝組學(xué)；液相色譜-質(zhì)譜；代謝通路

精神分裂癥是由患者個(gè)體心理易感因素和外部因素刺激等多因素誘發(fā)的一組癥候群組成的臨床綜合征，如思維障礙、感知聚障礙、意志和行為障礙、情感障礙以及認(rèn)知障礙［13］。精神分裂癥多發(fā)于青壯年，且病情多反復(fù)發(fā)作，是精神科的常見病、多發(fā)病。精神分裂患者一般需要終身服藥，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力。但目前精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本文采用基于HPLCMS的代謝組學(xué)方法研究女性首發(fā)精神分裂癥患者血漿樣品，鑒別女性精神分裂癥患者血漿代謝產(chǎn)物變化及標(biāo)志性代謝物，對(duì)女性首發(fā)精神分裂癥的分子機(jī)制進(jìn)行研究，以期為精神分裂癥患者體內(nèi)復(fù)雜的代謝變化和臨床診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取22例符合DSM-Ⅳ首發(fā)精神分裂癥的女性急性期住院患者為病例組，病程1～17a，平均（8.0±4.86）a，年齡18～42歲，平均（29.4±7.20）歲。根據(jù)性別、年齡、身高、體質(zhì)量、BMI等因素?zé)o顯著差異原則納入23例健康人群作為對(duì)照組，見表1。所有研究對(duì)象均無嚴(yán)重器質(zhì)性疾病，體檢、實(shí)驗(yàn)室及心電圖檢查均無臨床意義的異常；所有研究對(duì)象排除妊娠及哺乳、藥物過敏、酒精計(jì)藥物依賴患者。

表1 2組一般資料比較

1.2 標(biāo)本采集和保存 所有研究對(duì)象入院當(dāng)晚未服用任何抗精神病藥物，于次日06：30取血，樣本均保存于-80℃冰箱。血清樣品前處理：取100μL血清，加入300μL甲醇，渦旋3min，12 000r/min、4℃離心10min，取上清液即得供試品溶液。

1.3 儀器及試劑 儀器：液相色譜儀Agilent 1290Infinity UHPLC；質(zhì)譜儀Agilent 6538UHD and Accurate-Mass QTOF/MS；色譜柱Waters ACQUITY UPLC＠HSS T3（1.8μm 100×2.1mm）。試劑：甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨購(gòu)自美國(guó)默克公司（色譜級(jí)）；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.4 樣品的HPLC - MS方法測(cè)定 HPLC采用梯度洗脫，流動(dòng)相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈（0.1%甲酸）；流速0.4mL/min；柱溫40℃；Post Time 6min；進(jìn)樣量4μL，洗脫濃度見表2。

表 2HPLC梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：正離子模式：Gas Temp為350℃；Gas Flow 為11L/min；Nebulizer為45psi；VCap為4 000V；Fragmentor為120V；Skimmer1為60V；Octopole RF Peak為750 V；Reference Masses（m/z）為121.0509和922.0098。負(fù)離子模式：Gas Temp為350℃；Gas Flow為11L/min；Nebulizer為45psi；VCap為3 000V；Fragmentor為120V；Skimmer1為60V；Octopole RF Peak為750V；Reference Masses （m/z）為112.985587和1033.988109。

1.5 方法 穩(wěn)定性考察分別將按前述處理?xiàng)l件處理的樣品重復(fù)進(jìn)樣，考察系統(tǒng)及方法的穩(wěn)定性。將血清樣品按上述液相色譜-質(zhì)譜條件，在正離子模式下重復(fù)進(jìn)樣6次，將質(zhì)譜總離子流圖重合考察實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。為監(jiān)測(cè)系統(tǒng)及方法的穩(wěn)定性，在代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)加入質(zhì)控樣品（QC）。每6個(gè)樣品加入1個(gè)QC樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法的穩(wěn)定性良好。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣本中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物由Marker View TM軟件導(dǎo)出并合并峰表。矯正后的峰表代入SIMCA P11.0軟件包進(jìn)行最小二乘法判別分析，通過荷載圖中的VIP值尋找生物標(biāo)志物。將差異代謝物的精確分子量與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB、METLIN及KEGG）進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及MS/MS裂解碎片鑒別這些差異代謝物，最終確定精神分裂癥潛在生物標(biāo)志物及代謝途徑。

2 結(jié)果

2.1 2組血漿HPLC-MS總離子流色譜圖 按照前述色譜-質(zhì)譜條件，對(duì)2組血漿樣本分析，2組在正負(fù)離子模式下的總離子流圖（TIC）如圖1所示。

圖1 正、負(fù)離子模式下對(duì)照組、疾病組總離子流圖（TICs）A：正離子模式下健康對(duì)照組；B：正離子模式下疾病組；C：負(fù)離子模式下健康對(duì)照組；D：負(fù)離子模式下疾病組

2.2 2組主成分分析 為考察疾病狀態(tài)下患者代謝標(biāo)志物的變化情況，我們采用無監(jiān)督的主成分分析（PCA）表征健康對(duì)照組和模型組的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCA得分圖上對(duì)照組和病例組已有一定的分離趨勢(shì)，如圖2所示。

圖2 2組PCA得分圖A：正離子模式；B：負(fù)離子模式

2.3 潛在生物標(biāo)志物的篩選和鑒別 為篩選與精神分裂癥密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，本文采用有監(jiān)督的偏最小二乘法-判別式分析（PLS-DA）得到正、負(fù)離子模式下PLS-DA的Score圖、Scatter圖（S-Plot）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組區(qū)分明顯見圖3。進(jìn)一步通過student T-test，對(duì)2組差異變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得VIP＞1的差異代謝物。

圖3 正、負(fù)離子模式下健康對(duì)照組和疾病組PLS-DA 的Score圖，Scatter圖A：正離子模式下Score圖；B：正離子模式下Scatter圖；C：負(fù)離子模式下Score圖；D：負(fù)離子模式下Scatter圖

2.4 精神分裂癥潛在生物標(biāo)志物及相關(guān)代謝通路分析 本文將差異代謝物的精確分子量與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB、METLIN及KEGG）進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及MS/MS裂解碎片鑒別這些差異代謝物，最終確定了16個(gè)物質(zhì)為精神分裂癥潛在生物標(biāo)志物。16個(gè)標(biāo)志物中上調(diào)表達(dá)9個(gè)，分別為L(zhǎng)-亮氨酸、植物鞘胺醇、L-甲硫氨酸、2-氧代戊酸、乙酰絲氨酸、2-羥基戊酸及葡萄糖和α/δ-CEHC；下調(diào)表達(dá)的7個(gè)分別為3，4，5-三甲氧基肉桂酸、LysoPC（20：3）/（14：0）、PE（P-16：0/0：0）、甲蘋果酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺、PS（20：0/0：0）。

3 討論

精神分裂癥是臨床精神科常見病、多發(fā)病，對(duì)患者的感情、思維、行為及知覺等多方面產(chǎn)生嚴(yán)重影響。精神分裂癥是一種終身疾病，具有較高的致殘率。精神分裂癥的發(fā)病可能與患者的個(gè)體心理易感因素及社會(huì)外部因素刺激相關(guān)［45］。雖然目前臨床上對(duì)精神分裂癥患者以藥物治療為主，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。以符合DSM-Ⅳ首發(fā)精神分裂癥的女性急性期住院患者為病例組，女性健康志愿者為對(duì)照組，取2組患者血漿并進(jìn)行HPLC-MS的代謝組學(xué)分析，尋找女性首發(fā)精神分裂癥患者的生物標(biāo)志物，為相關(guān)的臨床診斷及治療提供參考。

精神分裂癥患者由于不健康的生活習(xí)慣、生活方式的影響，經(jīng)常存在糖、脂及氨基酸代謝紊亂［6-8］。食品中含有人體所必需的不同氨基酸及礦物質(zhì)。目前，全球罹患精神疾病的人數(shù)不斷上升，與人類飲食習(xí)慣改變、食用過多垃圾食品有關(guān)。精神分裂癥的谷氨酸假說提出精神分裂癥患者可能存在谷氨酸和甘氨酸等氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的不足、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體功能減退。早期研究證實(shí)，精神分裂癥患者腦脊液中的丙氨酸、甘氨酸及亮氨酸含量明顯高于正常人。S-腺苷甲硫氨酸參與轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)乙基及轉(zhuǎn)氨基等多個(gè)反應(yīng)，缺乏甲硫氨酸會(huì)導(dǎo)致抑郁癥或老年癡呆等，且補(bǔ)充甲硫氨酸可改善帕金森病及阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［9］。本文采用基于HPLC-MS的方法發(fā)現(xiàn)首發(fā)女性精神分裂癥患者存在氨基酸代謝通路的異常，L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、乙酰絲氨酸、2-氧代戊酸表達(dá)上調(diào)，而N-乙酰-L-谷氨酰胺下調(diào)，與以往研究結(jié)果一致。同時(shí)，谷氨酸是大腦中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，也可在系統(tǒng)能量不足時(shí)轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)產(chǎn)生ATP，表明精神分裂癥的發(fā)生也與能量代謝異常有關(guān)，與本文中發(fā)現(xiàn)葡萄糖是精神分裂癥潛在代謝標(biāo)志物一致。

精神分裂癥的細(xì)胞膜學(xué)說提出細(xì)胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸代謝限速酶基因的變異可能導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生。本文發(fā)現(xiàn)，脂肪酸的代謝異常也與首發(fā)精神分裂癥的發(fā)生有相關(guān)性，與精神分裂癥相關(guān)的代謝標(biāo)志物有2-羥基戊酸等，與以往研究證明的精神分裂癥發(fā)病與脂肪酸代謝途徑有關(guān)一致。本文發(fā)現(xiàn)α/δ-CEHC等與維生素E代謝有關(guān)的標(biāo)志物明顯上調(diào)，提示維生素E代謝通路也可能與精神分裂癥的發(fā)病有關(guān)。因此，通過基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)16個(gè)與女性首發(fā)精神分裂癥有關(guān)的代謝標(biāo)志物，可能與氨基酸、能量及維生素E代謝通路異常有關(guān)。

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表3 2組血漿中顯著差異代謝物及相關(guān)代謝通路分析

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（收稿2014-04-22）

Study of the pathogenesis of female with first onset schizophrenia by HPLC-MS

Qiao Ying，Li Huafang
Mental Health Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200030，China

Objective To study the pathogenesis of female with first onset schizophrenia through detecting the metabolites in plasma by HPLC-MS.Methods The plasma from all the research projects，normal project and female with first onset schizophrenia were analyzed by HPLC-MS in order to find out the biomarker related with the pathogenesis of female with first onset schizophrenia.Results Compared with control group，the metabolites in female with first onset schizophrenia were changed dramatically and 16biomarkers were discovered.Conclusion Abnormal metabolic pathways，including amino acid，vitamin E and energy metabolic were exists in female with first onset schizophrenia.

Schizophrenia；Metabonomics；HPLC-MS；Metabolic pathway

R749.3

A

1673-5110（2015）03-0001-03

上海市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，編號(hào)13ZR1435800

△通訊作者：李華芳，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：精神藥理學(xué)