鉀高效烤煙雜交品種花藥培養研究

周 田，戴林建，楊 蘇，陳 武，鄧 杰 (湖南農業大學農學院，湖南長沙410128)

煙草花藥培養是指改變花粉的發育程序，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，產生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株的一個過程［1］。鉀高效烤煙雜交品種是經多年試種而形成的富鉀煙葉品種，但經多年的觀察種植發現其常年發病，范圍廣，程度深。為尋求抗病優質烤煙，花藥培養在國際上取得巨大進步，從第1次毛蔓陀羅花藥培養取得的成功開始［2］，很多國家相繼進行了花藥培養方面的研究工作，使該技術在育種工作中不斷走向成熟，其可迅速獲得純合型材料，獲得育種中間材料，縮短育種年限，大大加快了育種速度，節省了大量的人力、物力。除此之外，還可作為遺傳工程受體［3］。鑒于此，筆者以3個鉀高效烤煙雜交品種為試驗材料進行了花藥培養，以期為實現既富含鉀又具穩定抗病性的優勢煙葉提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 材料 云87×GK3、K326×GK3、G80×GK5品種均由中南煙草試驗站提供。

1．2 方法

1．2．1 花藥預處理。晴天在田間采摘花粉正處單核靠邊期(花萼與花冠等長)的花蕊，放入5～7℃冰箱內低溫預處理，處理時間為1～3 d。

1．2．2 花藥消毒。取適量花蕊在一定大小容器中用無菌水沖洗2次，再用75%乙醇漂洗30 s，接著無菌水沖洗2次，而后用20%次氯酸鈉滅菌15 min，過后無菌水沖洗4次，置于無菌濾紙上除濕。

1．2．3 培養基制備。試驗直接采用市場上人工合成的MS培養基，具體為1/2MS+20 g蔗糖+1 000 ml水+7 g瓊脂，滅菌冷卻至50℃左右后加入激素0．80 g/L 6-BA和0．16 g/L IAA，pH 5．8。生根培養基無需加激素類，將蔗糖量調為30 g和pH調為6．0即可。

1．2．4 花藥接種與培養。在25℃、每天光照12 h的培養條件下剝取消毒過的花藥置于培養基中，觀察記錄各時期花藥特征。待花藥萌發出苗后，計算出苗率并將其進行分株，明確煙苗株數。

2 結果與分析

2．1 不同煙草雜交品種花藥培養誘導頻率差異 用1/2MS的培養基進行不同煙草雜交品種的花藥培養，試驗共接種3個品種，分別是云87×GK3、K326×GK3、G80×GK5，均為高鉀雜交種，所有品種均培養出苗，但花藥萌發率卻存在差異。由表1可知，云87×GK3的萌發率最高，K326×GK3次之，G80×GK5最低。云87×GK3的花藥萌發率為9．6%，接近于K326×GK3的花藥萌發率(9．1%)，而G80×GK5的萌發率卻只有4．0%，與前兩者存在較大差異。這可能與雜交品種的不同有關，前2個雜交品種均是與GK3雜交，而后者是與GK5雜交，且雜交原種也各不相同，這可能是導致各品種萌發率不同以及前兩者與后者萌發率相差大的原因。

表1 不同煙草雜交品種花藥培養誘導率差異

2．2 不同煙草雜交品種的單個花藥培養成苗株數差異 供試的3個高鉀雜交品種均處在相同培養基、同一溫度等條件下誘導培養，所有萌發的花藥均由愈傷組織或胚狀體發育成正常煙苗，但單個花藥的出苗株數卻各不相同。由表2可知，云87×GK3的已萌發的花藥中，平均每個花藥可長出6株左右煙苗，而 K326×GK3和G80×GK5卻只有2．38和2．00株，明顯低于云87×GK3。究其原因，可能是因為品種基因型不同，品種不同，花藥中的花粉的抗逆性就有強有弱，由胚狀體長成植株的數目也就有多有少，這種隨機性是無可預估的，同時還存在試驗中因細菌感染或光照問題產生畸形苗而使少量植株中途死亡，致使苗數減少而產生試驗誤差。

表2 不同煙草雜交品種花藥培養成苗株數差異

2．3 低溫預處理時間和溫光條件對煙草花藥培養的影響 試驗的花藥預處理時間為1～3 d，在培養過程中如花藥處理時間在2 d內，消毒則會正常進行，若超過2 d甚至3 d，花藥消毒過程中則會嚴重傷到花萼和花冠，甚至感染到花藥。這可能與花蕊的保鮮性有關，致使花蕾失活萎蔫失去對花藥的保護能力。所以花藥最適處理時間為1～2 d。

花藥接種在培養基后，移至25℃左右的培養室中培養，每天光照12 h，超過3 d左右，花藥由嫩綠色變為淡黃色，接著又變為黃褐、褐色，花藥體積不斷膨脹，10～15 d花藥裂開并伴隨乳白色胚狀體的出現，并逐漸發育成小植株。但也不全是按照上述理論時間段來發展，有的花藥長達3個月以上才形成小植株。若花藥培養溫度在20℃以下，花藥不僅難以萌發，萌發出的煙苗也難以成活，且在光照不足的情況下還易形成白化苗、玻璃苗等，影響花藥培養的成效。

3 結論與討論

隨著現代生物科技的進步，煙草花藥培養技術已獲得穩定的發展，尤其是常規烤煙品種花藥培養。而目前烤煙面臨的大面積病害與煙葉質量惡劣等問題迫使人們為獲得既抗病又優質的煙葉而不斷探索更加簡捷有效的方針。該試驗利用高鉀雜交品種進行煙草花藥培養，結果表明，3個雜交品種的煙草花藥均能萌發出胚狀體并長出正常植株，盡管伴隨著個體差異，但正因為這些差異才體現出品種間的特異性。

在不同品種花藥萌發誘導率的對比中，云87×GK3和K326×GK3的萌發率趨于相近，明顯高于G80×GK5，這可能與GK3和GK5品種間的差異有關。有研究表明單倍體培養的胚產量和質量是由基因型決定的，是影響單倍體培養的主要因素［4］。而在后來的單個花藥培養成苗株數的對比中，各個品種依然存在差異，其差異趨勢又與花藥萌發誘導率截然不同，沒有明顯的規律，該現象不能單單追溯品種的基因問題，更與試驗過程中操作不當造成花藥感染失活產生的誤差有關。

通過近幾年的發展可以看出，煙草花藥培養必將在煙草遺傳育種研究中占據不可替代的地位，但是煙草花藥培養技術有待改善和提高。應充分了解花藥培養過程中的有利因素，如花藥培養的最適時期［5］、預處理溫度與時間［6］、激素的種類及適當的濃度配比［7］、培養基添加活性炭效應［8］、接種植株的生長環境控制等對花藥培養效果的影響，提高胚狀體的誘導頻率。此外，花藥培養出的純系品種在后代中可能表現出基因的不穩定性，使品種發生變異，因此，應結合花藥培養技術的改進來削弱后期的變異，或者為花藥培養品種尋求更多穩定可行的技術。

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