蘭花種子萌發研究進展及對國蘭雜交育種的啟示

李風童　包建忠　孫葉　劉春貴　馬輝　張甜　陳秀蘭

摘要：綜述了中國蘭花育種概況以及蘭花種子萌發研究現狀，對共生萌發及非共生萌發技術在蘭花種子萌發中的應用進行了總結，重點闡述了種子胚胎發育特點及發育階段對種子非共生萌發的影響，指出了深入研究國蘭種子胚胎發育特性的必要性，旨在為今后促進中國蘭花育種提供參考。

關鍵詞：蘭花；種子萌發；胚胎發育；中國蘭花育種

中圖分類號： S682.310.36 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0013-03

廣義的蘭花是整個蘭科（Orchidaceae）植物的總稱，是目前單子葉植物中最大的一個科，同時也是單子葉植物中最進化的一個科。蘭花廣泛分布于全世界各地，據統計約有800個屬，30 000～35 000個種[1]。國蘭特指中國境內蘭屬（Cymbidium Sw.）植物部分地生種，中國是蘭屬植物的分布中心，目前已記載有49種，其中19種為特有種[2]。中國蘭作為中國的傳統名花，因其株型典雅、花姿優美、幽香四溢，自古以來深受人們的喜愛，主要以春蘭 [C. goeringii （Rchb. f.） Rchb. f.]、蕙蘭（C. faberi Rolfe）、建蘭 [C. ensifolium （L.） Sw.]、墨蘭 [C. sinense （Jackson ex Andr.） Willd.]、寒蘭（C. kanran Mak.）等地生蘭為代表[3]。

蘭花因其重要的觀賞、經濟及科研等價值，種子萌發機理一直是各國蘭科植物學家所研究的熱點之一，為部分瀕危蘭花的保育及重要觀賞蘭花的育種作出了重要貢獻，但部分地生蘭種子萌發機理仍然是當前研究的難點，國蘭方面的相關研究基礎更為薄弱。本研究綜述了當前部分蘭花種子發育方面的研究進展以及國蘭雜交育種概況，重點闡述了可能影響蘭花種子萌發的胚胎學機理，旨在為提高國蘭種間雜交種子萌發率以及國蘭雜交育種效率提供技術依據。

1 中國蘭花雜交育種概況

中國蘭花在我國有著悠久的栽培歷史，在長期的野外采集和栽培中出現了許多優良的變異品種。近20年來，深受日本、韓國、臺灣蘭花市場的影響，國蘭的采挖、種植、銷售產業發展較快，選擇育種成為當時國蘭育種的重要手段，雖然也選育出許多優良的自然變異植株（品種），但卻導致國蘭自然資源掠奪性的采挖和珍貴種質資源外流[4]，積極有效開展國蘭育種工作，推進國蘭種質資源創新就顯得迫在眉睫。吳漢珠等首次報道了中國蘭應該綜合采用生物技術、核技術、雜交育種等多種途徑進行育種，并相繼報道了49個雜交組合的種子萌發情況，其中包括了蘭屬內地生種與地生種之間的雜交，培育出新品種10多個[5]，這是我國蘭花栽培歷史上一個新的起點。近年來，基因克隆[6-7]、體細胞快繁[8-10]、輻射誘變[11-12]、同工酶分析[13]、分子標記[14-16]等技術手段已在國蘭育種及種質資源評價中有所應用，為提高國蘭育種效率提供了參考，但效果卻極為有限，開展國蘭種間以及品種間常規雜交育種仍然是國蘭育種中使用最為普遍、最重要的一種方法。

目前，中國蘭尤其是原生種，因為其優良的抗性、香味和觀賞特性已作為重要親本被廣泛應用到大花蕙蘭等洋蘭的雜交育種中去[17-20]。近年來，雖然針對國蘭種間雜交育種的報道逐漸增多，而國蘭新品種的人工培育工作無論是從規模上，還是在研究進展方面，基本處于剛剛開始探索階段，在種間遠緣雜交方面更是缺乏系統研究。張志勝等開展了中國蘭花墨蘭和春蘭、建蘭和墨蘭、建蘭和寒蘭等種間雜交研究，發現不同雜交組合雜交種子萌發率存在較大差異，但并未深入研究其原因[17]；徐曉薇等開展了寒蘭和春蘭、寒蘭和墨蘭種間雜交研究，發現雜交易成功，但未對雜交種子的萌發開展深入研究[2]；李枝林等曾開展蕙蘭與墨蘭的種間雜交，但因數量較少，只開展了2朵花的雜交，并未得到雜交種子[21]。相對于洋蘭在品種改良方面取得的巨大成功，中國蘭的雜交育種工作進展及商品化進程則相當緩慢，其中一個重要原因就是其雜交種子萌發難，雜種試管苗生產效率低[17]。國蘭雜交種子尤其是遠緣雜交種子培養比洋蘭困難，種子萌發需時長，萌發率低。作為國蘭育種的關鍵環節，種子的萌發直接關系到國蘭雜交育種的效率和成敗。因此，對國蘭雜交尤其是遠緣雜交種子發育特性以及萌發機理開展深入研究，建立高效萌發體系尤為必要。

2 蘭花種子萌發研究現狀

2.1 蘭花種子的共生萌發

蘭花種子極其微小，種皮內僅有1個發育不完全的胚，沒有胚乳和子葉，只有脂滴和少量蛋白質，缺乏萌發過程中所需要的后備營養[22-24]，自然條件下萌發率極低。20 世紀初，法國的Bernard 和德國的Burgeff 就證實，只有感染了合適的真菌后，蘭科植物的種子才能在自然生態條件下萌發生長，隨著國內外學者的深入研究，逐漸確立了蘭花種子與真菌菌根的共生體系[25]。目前，蘭花菌根已成為菌根研究中很重要的組成部分，眾多研究表明，蘭花菌根在促進蘭花種子萌發及幼苗生長方面具有重要的生態作用。一是蘭花種子只有經過真菌菌絲穿過種皮之后，通過胚胎細胞消化菌絲的方式才能萌發，在萌發的早期階段利用真菌分解原球莖中的貯存物，并向其提供有機和無機養分保證原球莖的生長發育[26-28]；二是雖然大部分蘭花在成苗后可獨立進行光合作用，不需要真菌提供碳源，但是蘭花和真菌已形成共生體系，仍然會通過共生真菌吸收環境中的磷、磷、鉀等營養元素及水分[29-31]。目前，國外對于蘭花菌根研究較為深入，在真菌的分離、鑒定和篩選等方面也較為成熟，蘭花種子共生萌發技術已經在許多蘭科植物中有所應用，并取得較高的種子萌發率和成苗率[32-34]。國內對于蘭花菌根研究則相對比較薄弱，主要集中在菌根真菌多樣性分析[35-36]和真菌的分離和鑒定[37-38]，對于共生萌發的研究則較少。楊友聯等采用從獨蒜蘭（Pleione bulbocodioides）分離的菌根真菌與其種子在燕麥培養基上共生萌發，發現不同菌根真菌種有的能明顯促進種子萌發，有的則會引起原球莖死亡[39]。范黎等研究發現，開唇蘭小菇（Mycena anoectochila）可與天麻（Gastrodia elata）種子共生，并顯著促進其原球莖的生長[25]。雖然蘭花種子共生萌發技術對于促使幼苗根系菌根化、提高幼苗成活率具有重要意義，對于部分野生蘭花的保育具有重要價值，但蘭花與其共生真菌之間的關系十分復雜，許多問題諸如對真菌的專一性、真菌的侵入機制、蘭花與真菌共生系統調控、營養物質轉運等的了解仍然遠遠不夠，加之共生萌發技術的操作極為繁瑣，致使其在生產上的應用十分有限，因此，非共生萌發技術在蘭花繁殖及育種研究中仍然占有非常重要的地位。

2.2 蘭花種子的非共生萌發

目前，國內外對于蘭花種子非共生萌發的研究報道大多集中在對非共生培養體系中培養基配方進行篩選[20，40-42]、對種子進行預處理[43-45]等方面，用以提高種子的萌發率。但以上方法僅僅依靠改變種子萌發的外在環境，種子本身的發育特點是否直接影響種子萌發率還不得而知。許多研究發現，蘭花未成熟種子的萌發率要顯著高于成熟種子的萌發率。如杓蘭屬（Cypripedium）幾個種的成熟種子萌發遠比未成熟種子困難[46-47]。Deb 等認為紋瓣蘭[Cymbidium aloifolium （L.） Sw.]授粉后果莢的發育階段是其種子能否順利萌發的關鍵因素，同時發現授粉后9 個月的未成熟種子萌發效果最好，而大于11 個月的種子萌發出現畸形[48]。徐曉薇等研究了果齡對寒蘭雜交種子萌發的影響，發現雜交授粉后180～240 d 為寒蘭種子的最佳采收時間，早于180 d，種子萌發欠佳；晚于240 d，種子萌發率顯著下降[2]。以上研究均表明，蘭花種子在不同發育階段存在不同的萌發特性。有研究報道，蘭花種子發育過程中，蛋白及多糖含量發生了變化，胚柄細胞起著重要的調節作用[49-51]。此外，蘭花種子發育后期珠被細胞會發生角質化也會影響種子萌發，Yamazaki等對金蘭（Cephalanthera falcata）人工授粉后50～120 d 的種子萌發及發育特性進行研究，發現授粉后70 d 的種子萌發率達到最高，時間越長萌發率越低，同時發現種子發育后期（授粉后90 d），包圍胚胎的內珠被開始積聚木質素，并最終纖維化和角質化，有可能會導致種子的休眠[41]。Lee等也發現臺灣杓蘭（Cypripedium formosanum）種子發育后期（授粉后135 d）萌發率極低，內珠被同樣檢測到角質化物質，同時利用不同培養基配方和對種子進行預處理等方法檢測種子萌發率，認為種子的采收時間更能影響種子的萌發率[52]。

3 對國蘭雜交育種的啟示

國蘭種內及種間雜交結實較容易，普遍可得到雜交果實，但種子萌發困難，國內對于影響其萌發的機理研究報道較少，借鑒前人相關研究成果，我們得出如下設想：（1） 雜交種子發育是否正常？既然能結實說明可完成部分授粉受精，但是，因為種子極其微小，受精以后胚胎的發育是無法預知的，成熟種子的胚胎是否正常？正常種子比例是多少？種子活力如何？可開展深入研究。（2）如果胚胎發育異常，相關機理是什么？胚胎發育與其細胞超微結構變化、營養物質積累以及胚柄細胞的活動狀態都有緊密的聯系，具體哪個環節出現異常？還需要深入研究。（3）如果胚胎發育正常，是什么原因導致了種子萌發率低？可結合胚胎發育特性、檢測珠被細胞角質化物質積累以及培養基配方的影響等方面進行探討。國蘭在我國有著悠久的栽培歷史，而且蘊含濃厚的蘭文化，5種國蘭各具特色，如春蘭株型典雅；蕙蘭香氣濃郁，抗逆性強；墨蘭葉形漂亮，葉色變異豐富；建蘭可多季開花且花色花型變異豐富；寒蘭則株型修長，香味清醇。開展中國蘭種內和種間遠緣雜交育種具有非常重要的意義，如能明確影響其種子萌發的胚胎學機理，同時結合不同發育階段雜交種子在不同培養基配方的非共生萌發情況，揭示胚胎發育特性與種子萌發的關系，上述研究工作不僅將有助于我們從細胞水平上為建立國蘭雜交種子的高效萌發體系提供理論支持，而且可采取有效措施適時采收雜交種子、縮短國蘭育種周期促進國蘭種質資源創新，也可進一步豐富國蘭生殖生物學資料，為國蘭其他相關研究提供重要的理論依據。

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