丙戊酸促進神經母細胞瘤細胞自噬性死亡

通信作者：王志紅(1981-)，女，碩士，主治醫師，主要從事婦科腫瘤發生機制研究。E-mail：misswang19811981@163.com

丙戊酸促進神經母細胞瘤細胞自噬性死亡

王雪晶1，滕軍放1，丁雪冰1，馬明明2，王志紅3

(1.鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450052；

2.河南省人民醫院神經內科，河南 鄭州 450003；

3.鄭州大學第二附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450014)

[摘要]目的探討丙戊酸(VPA)對神經母細胞瘤細胞自噬性死亡的調控。方法用含不同濃度的VPA培養基培養SH-SY5Y細胞，應用MTT法檢測細胞的存活率，乳酸脫氫酶(LDH)檢測細胞損傷，單丹磺酰尸胺(MDC)染色評價細胞質內酸性自噬泡的形成，Western blotting法檢測巨自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表達。結果與對照組比較，VPA孵育48 h后，SH-SY5Y細胞存活率明顯降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)；SH-SY5Y細胞培養基中LDH明顯增高，且具有劑量依賴性(P<0.05)；VPA誘導細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表達水平明顯上調(P<0.05)。結論VPA誘導神經母細胞瘤細胞細胞自噬性死亡，為神經母細胞瘤的治療提供新的手段。

[關鍵詞]丙戊酸；神經母細胞瘤；細胞自噬性死亡

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81241046)

作者簡介：王雪晶(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事神經退行性疾病研究。E-mail：ballet8114@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.02.001

[中圖分類號]R730.264;R730.23

收稿日期：(2015-02-10)

Valproic Acid Induced Autophagic Cell Death of SH-SY5Y Cells

Wang Xuejing1,Teng Junfang1,Ding Xuebing1,Ma Mingming2,Wang Zhihong3

(1.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;

2.DepartmentofNeurology,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China;3.Departmentof

ObstetricsandGynecology,theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Abstract[]ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of valproic acid (VPA) on autophagic cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells.MethodsWe used different concentration of VPA to treat SH-SY5Y cells.MTT was used to detect the viability of SH-SY5Y cells,layered double hydroxides (LDH) was used to evaluate the damage of cells,monodansylcadaverine (MDC) staining was used to mark autophagic vacuoles.The autophagy-related protein expressions of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Beclin-1 were detected by Western blotting analysis.ResultsAfter treatment of VPA for 48 hours,the viability of SH-SY5Y cells were significantly decreased in dose-dependent manner (P<0.05); and VPA increased LDH level in culture media in dose- dependent manner (P<0.05).Compared with the control group,the levels of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin-1 were significantly increased in the VPA treatment groups (P<0.05).ConclusionVPA induces the autophagic cell death of neuroblastoma SH-SY5Y cells,VPA thus may be a new target for treatment of neuroblastoma.

[Key words]valproic acid; neuroblastoma; autophagic cell death

丙戊酸(valproic acid，VPA)為經典的組蛋白乙酰化抑制劑，廣泛運用于抗癲癇的治療中[1]。以往研究[2]證實，組蛋白乙酰化抑制劑具有抗腫瘤的作用，可能的分子機制為抑制HDAC活性，使組蛋白失去乙酰化狀態，因此細胞核中組蛋白乙酰化水平提高，激活核小體內一些轉錄相關因子被激活，細胞阻滯在G1或G2/M期，阻止異常增殖而具有抗腫瘤作用[3]。神經母細胞瘤是兒童最常見的顱外原發腫瘤，目前尚無有效治療手段。本實驗以人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y為研究對象，探討VPA通過調控SH-SY5Y細胞自噬水平誘導其死亡的具體機制。

1材料與方法

1.1細胞培養人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，常規培養于含體積分數15%胎牛血清的DMEM完全培養基中，置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養，每天換液1次。待細胞鋪滿培養瓶底90%左右，以消化液(含質量分數0.30%胰蛋白酶和質量分數0.05% EDTA)消化，14比例稀釋、傳代培養。

1.2MTT法檢測細胞存活率SH-SY5Y細胞接種于96孔板(密度為2×103/孔)，次日對照組給予常規DMEM培養液，實驗組分為3個濃度組，分別加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，每組設4個復孔，培養48 h，棄去培養基，每孔加10 μL MTT和90 μL無血清DMEM培養液，37 ℃孵育2 h，棄去液體，加入150 μL DMSO振蕩溶解，酶標儀于570 nm波長處測量吸光度(A)值，細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.3LDH釋放檢測實驗組加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，培養48 h后，收集細胞培養基，按照乳酸脫氫酶(layered double hydroxides，LDH)試劑盒說明操作并計算LDH釋放率。

1.4MDC檢測細胞自噬空泡變化單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色檢測自噬空泡的標志物，通過MDC染色判斷細胞自噬過程。SH-SY5Y細胞分別加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，培養48 h后，以質量分數4%多聚甲醛，4 ℃固定10 min，PBS洗3遍，加入終濃度為50 μmol·L-1的MDC染色液，37 ℃下孵育80 min，PBS洗5遍，熒光顯微鏡下觀察細胞自噬空泡的變化。

1.5Western blot法分析蛋白表達SH-SY5Y細胞分別加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，培養48 h后，提取細胞總蛋白，做SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至硝酸纖維濾膜上。膜用體積分數5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗Beclin 1(1800)、抗LC3(1300)抗體，4 ℃過夜。TBST漂洗3次，加人過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(15 000)，置于水平脫色搖床上孵育2 h，TBS漂洗3次，ECL光化學法顯色。凝膠成像分析系統分析掃描，測定各條帶積分光密度值，計算目的條帶與內參照的光密度比值。

2結果

2.1VPA對SH-SY5Y細胞存活率的影響MTT法檢測結果顯示：0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，SH-SY5Y細胞存活率分別為(97.0±9.1)%、(76.2±10.2)%、(52.1±16.2)%，處理組與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1　VPA對SH-SY5Y細胞存活率的影響

注：1)與對照組比較，P<0.05

2.2LDH活性檢測SH-SY5Y細胞經0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，收集培養上清液，按照LDH試劑盒說明操作并計算LDH釋放率。LDH釋放率(%)=上清LDH/總LDH×100%，以對照組為 100.0%，實驗組與對照組比較。0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，SH-SY5Y細胞LDH釋放率為(100.0±4.3)%、(133.0±8.5)%、(152.0±7.3)%，后2組與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見圖2。

圖2　VPA對SH-SY5Y細胞LDH釋放的影響

注：1)與對照組比較，P<0.05

2.3MDC熒光檢測自噬體形成SH-SY5Y細胞經0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，MDC染色結果顯示，VPA導致MDC染色信號增強，自噬空泡聚集增多，表明VPA誘導了細胞巨自噬的發生。見圖3。

圖3　MDC熒光檢測顯示自噬小體的形成

A：VPA 0 mmol·L-1;B:VPA 1 mmol·L-1;C:VPA 2 mmol·L-1

2.4Western blot分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1水平的變化SH-SY5Y細胞經0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，后2組LC3-Ⅱ表達水平逐漸上調，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸上調，明顯高于對照組(P<0.05)，與對照組比較，后2組Beclin-1表達水平逐漸上調(P<0.05)。見圖4。

圖4　Western blot法檢測VPA對LC3及Beclin-1水平的調控

3討論

神經母細胞瘤是兒童期最常見的外周神經系統惡性腫瘤，占此年齡段腫瘤的30%，是由交感神經細胞惡性增殖演變而來[4]。該腫瘤惡性程度高，多數患者雖經化療、放療及生物治療生存率仍很低，探索能夠延長生存期及提高患者的生活質量的新藥物勢在必行[5]。

細胞壞死和凋亡是細胞死亡的2種主要方式。細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，包括Ⅰ型(細胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性細胞死亡)[6]。細胞自噬過程是機體一種重要的防御和保護機制。蛋白或細胞器包被進入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而降解其所包裹的內容物，藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，維持細胞內穩態[7]。因此，保持一種基礎低水平的自噬活性對細胞的生理活動至關重要，然而細胞中自噬過度激活將誘發細胞死亡[8]。

本研究發現，VPA可誘導SH-SY5Y細胞巨自噬的激活，導致巨自噬標志物LC3及Beclin-1表達上調，MDC染色顯示VPA孵育后自噬小體呈現明顯聚集，且呈劑量依賴性。進一步研究證實，VPA誘導了SH-SY5Y細胞活力下降，LDH釋放增加，以上結果證實VPA誘導了SH-SY5Y細胞的損傷，增加了SH-SY5Y細胞的死亡。綜上所述，本研究證實VPA能夠通過誘導巨自噬上調促進SH-SY5Y細胞的死亡。且本研究還發現，隨著VPA濃度的增加，SH-SY5Y細胞存活率明顯降低，細胞損傷逐漸加重，呈現劑量依賴性。總之，VPA通過誘導自噬抑制了SH-SY5Y細胞的生長，促進細胞自噬性死亡過程，為神經母細胞瘤的治療提供了新的治療手段及理論依據。

參考文獻：

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[4]Schleiermacher G,Janoueix-Lerosey I,Delattre O.Recent insights into the biology of neuroblastoma[J].Int J Cancer,2014,135(10):2249-2261.

[5]Irwin MS,Park JR.Neuroblastoma:paradigm for precision medicine[J].Pediatr Clin North Am,2015,62(1):225-256.

[6]Lalaoui N,Lindqvist LM,Sandow JJ et al.The molecular relationships between apoptosis,autophagy and necroptosis[J].Semin Cell Dev Biol,2015.

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[8]Muzes G,Constantinovits M,Furi I et al.Interaction of autophagy and Toll-like receptors:a regulatory cross-talk--even in cancer cells?[J].Curr Drug Targets,2014,15(8):743-752.