內共生菌Wolbachia在不同種群灰飛虱中的感染及對宿主生殖的影響

謝霖　史燕洪　劉寶生　方繼朝

摘要：為明確實驗室內飼養的3個灰飛虱地理種群（云南楚雄、江蘇南京、江蘇建湖）共生菌Wolbachia的感染情況以及Wolbachia對灰飛虱生殖的影響，首先利用PCR技術對這些種群的Wolbachia進行檢測，發現所有種群均感染了Wolbachia，楚雄、南京、建湖種群的感染率分別為91.5%、66.1%、84.0%。接著用Wolbachia的wsp基因的特異性引物從3個地理種群中都擴增出1段599 bp的基因片段，通過測序發現這3個種群的Wolbachia具有完全相同的wsp基因序列，同屬于Con株系。最后，在嚴格的試驗條件下對建湖種群的灰飛虱進行了雜交試驗，結果表明：Wolbachia對灰飛虱生殖表現出高強度的單向胞質不親和；Wolbachia可能對宿主生殖具有負面影響；另外，研究還發現親本雙方全部感染Wolbachia時，其子代感染率僅為82.14%，Wolbachia的卵傳率未達到100%，這可能與Wolbachia在灰飛虱種內的垂直傳播有關。

關鍵詞：灰飛虱；Wolbachia；感染率；生殖力；胞質不親和；地理種群

中圖分類號： S435.112+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0145-04

沃爾巴克氏體（Wolbachia）是存在于節肢動物體內的一種立克次氏體共生菌，其分類地位屬原核生物界、細菌門、變形菌綱的α亞綱、立克次氏體目、立克次氏體科、Wolbachia屬，在宿主中通過細胞質遺傳給下一代。據統計，目前有15%～20%的昆蟲感染了這類細菌，是迄今為止已知的最廣泛存在的胞內共生菌之一，遍及昆蟲綱的十多個目，灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallèn）體內也有這種立克次氏體細菌[1]。這類細菌能夠對宿主進行生殖調控，引發宿主多種生殖異常行為，導致細胞胞質不親和（cytoplasmic incompatibility，CI）[2]、雌性化（feminization）[3-4]和孤雌生殖（parthenogenesis inducing，PI）[5-6]等現象，其中研究最多的是細胞胞質不親和現象。細胞胞質不親和現象通常出現在2種交配情況，即感染了Wolbachia雄性個體與非感染的雌性個體交配（單向CI），或與感染了不同品系的Wolbachia的雌性個體交配（雙向CI），這2類交配產生的后代在胚胎發育的早期就全部或大部分死亡，而其他組合方式的交配則產生正常數目的子代。通過對宿主生殖和適合度的調控，Wolbachia能夠穩定地在種群間進行水平和垂直傳播，這樣Wolbachia就能有效侵入宿主群體并在宿主群體內擴散，在Wolbachia擴散的同時，還能帶動與之相聯系的其他細胞質因子在宿主群體間傳播。

灰飛虱屬同翅目（Homoptera）飛虱科（Delphacidae），是目前影響我國水稻穩產、高產的主要害蟲之一。其廣泛分布于東亞、東南亞、歐洲和北非等地，幾乎遍及我國所有的稻區，包括華南、華中、華北、東北以及西南稻區，其中以長江中下游和華北稻區發生較多[7]?；绎w虱最具毀滅性的危害方式是傳播水稻條紋葉枯病，該病自20世紀60年代被發現以來，已在16個省、市、區均有發生，成為我國分布最廣、危害最嚴重的一種水稻病毒病，嚴重時可造成水稻大面積減產甚至絕收[8]。

近年來，研究發現Wolbachia能引起灰飛虱的生殖異?，F象[9]，為進一步明確實驗室內飼養的不同灰飛虱地理種群共生菌Wolbachia的感染情況，了解Wolbachia對灰飛虱的生殖調控作用，本試驗利用PCR技術對不同地理種群灰飛虱體內的Wolbachia進行檢測，并對灰飛虱群體進行遺傳雜交試驗，為了解Wolbachia在宿主群體間的水平和垂直傳播規律以及近幾年發生的灰飛虱再猖獗現象提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料及飼養方法

供試灰飛虱成蟲分別于2001年5月采自云南省楚雄市、2009年5月采自江蘇省南京市、江蘇省建湖縣，隨后在人工氣候室內用武育粳3號稻苗分別飼養至今，飼養條件為溫度（25±1） ℃、相對濕度60%、光照周期16 h（日）/8 h（夜）。

1.2 灰飛虱總DNA的提取

在裝有單頭灰飛虱成蟲的1.5 mL離心管內加入200 μL研磨緩沖液（100 mmol/L NaCl，200 mmol/L蔗糖，pH值9.1的100 mmol/L Tris-HCl ，50 mmol/L EDTA，0.5% SDS，100 μg/mL蛋白酶K），研磨勻漿后再加入200 μL研磨緩沖液混勻，65 ℃溫育1 h，加入乙酸鉀（8 mol/L）至終濃度1 mol/L，冰上靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，吸出上清，加入2倍體積的無水乙醇，在-20 ℃放置過夜，充分沉淀DNA，次日于12 000 r/min離心15 min，干燥后溶解于 30 μL 超純水中。

1.3 PCR檢測灰飛虱體內的共生菌Wolbachia

參考Zhou等根據Wolbachia wsp基因序列設計的1對特異性引物來檢測灰飛虱是否感染共生菌[10]，上游、下游引物分別是：5′-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3′、5′-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3′。25 μL PCR反應體系組成為：15.3 μL ddH2O，2.5 μL 10×Buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL dNTPs（各2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，0.2 μL Taq DNA聚合酶（大連TaKaRa公司），上下游引物各0.5 μL（各10 μmol/L）。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察并記錄結果。endprint

1.4 序列測定

PCR擴增產物經回收純化后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測定序列。每個地理種群隨機抽取5個已感染Wolbachia的樣本進行序列測定，以它們的一致序列為準。

1.5 篩選100%感染和100%不感染Wolbachia的灰飛虱品系

1.5.1 篩選100%感染Wolbachia的灰飛虱品系 隨機挑選在建湖縣田間采集的自然種群灰飛虱雌蟲、雄蟲各1頭于一次性透明塑料杯中進行配對產卵，配對20對左右，1周后將成蟲挑出用PCR檢測Wolbachia的感染情況。待卵全部孵化成若蟲后，保留雙親都感染Wolbachia的后代繼續飼養。待F1代長至成蟲時重復上述步驟進行繼代飼養，從而獲得100%感染Wolbachia的純系（用“W+”表示）。

1.5.2 篩選100%不感染Wolbachia的灰飛虱品系 隨機挑選建湖縣田間采集的自然種群灰飛虱，于0.1%四環素藥水浸泡的稻苗上飼養，連續繼代飼養3代后用PCR技術對灰飛虱進行Wolbachia檢測，結果表明均不感染Wolbachia，從而獲得100%不感染Wolbachia的純系（用“W-”表示）。

1.6 遺傳雜交試驗

為檢驗Wolbachia對灰飛虱生殖的影響，選用江蘇建湖種群篩選出的2種灰飛虱品系進行遺傳雜交試驗，4種雜交組合分別為：♀（W+）×♂（W+）、♀（W-）×♂（W-）、♀（W+）×♂（W-）、♀（W-）×♂（W+）。

試驗具體方法為：在每根玻璃試管中套入1頭5齡灰飛虱若蟲，然后扎好試管口待其羽化，以確保用于雜交的雌蟲、雄蟲都是未交配過的。將剛羽化的雌蟲、雄蟲各1頭配對于長有水稻苗的一次性透明塑料杯中，讓其交配產卵5 d，每天更換產卵稻苗，5 d后移走雌蟲、雄蟲，每個雜交組合至少有5個重復，當卵孵化為若蟲后，記錄有效產卵量、卵孵化期、若蟲的發育歷期、雌雄性比、后代感染率等結果，最后解剖用于產卵的稻苗，記錄產卵日期、未孵化卵量，從而得到不同組合灰飛虱的產卵前期、總產卵量和孵化率。

1.7 數據整理和分析

每組雜交試驗均至少設置5個重復，所得數據均采用DPS軟件（7.05版）中的Tukey多重比較方法進行單因素試驗統計分析，每組數據取平均值進行不同組合的差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 Wolbachia在灰飛虱種群中的感染情況及各種群wsp基因序列比較

對3個灰飛虱種群中Wolbachia的感染情況進行檢測，結果顯示，所有種群均感染Wolbachia（表1），楚雄、南京、建湖種群的感染率分別為91.5%、66.1%、84.0%，3個種群Wolbachia的感染率都較高。

用Wolbachia的wsp基因特異性引物從3個地理種群中都擴增出1段599 bp的基因片段，測序后將各種群的基因片段序列上傳至NCBI并獲得GenBank登錄號，分別為JN104053（楚雄種群）、JN104054（建湖種群）、JN104055（南京種群）。使用GeneDoc對3個地理種群灰飛虱體內Wolbachia的wsp基因序列進行比較發現，這3個種群的Wolbachia具有完全相同的wsp基因序列，而且和Con品系Wolbachia的wsp基因序列（GenBank登錄號AF020080）完全相同（圖1）[10]，說明這3個種群的灰飛虱感染的Wolbachia同屬于Con株系。

2.2 Wolbachia對灰飛虱生殖的影響

在江蘇建湖灰飛虱種群的雜交試驗中，感染Wolbachia的雄性灰飛虱與未感染Wolbachia的雌性灰飛虱交配后，每天觀察產卵稻苗都未發現若蟲孵出，將稻苗保濕培養2周后解剖，發現稻苗內有未孵化的卵；而其他3個雜交組合配對后8～9 d 就會發現有若蟲孵化，說明它們均能正常交配并產生后代。

從表2可以看出，是否感染Wolbachia對灰飛虱的產卵前期和卵孵化率沒有顯著影響，但對卵孵化期、有效產卵量、總產卵量有顯著影響。未感染Wolbachia的雌蟲所產的卵孵化期極顯著長于感染Wolbachia的雌蟲所產的卵；未感染Wolbachia的雄蟲與未感染Wolbachia的雌蟲交配產生的卵量顯著多于與感染Wolbachia的雌蟲交配產生的卵量。

2.3 不同雜交組合后代若蟲Wolbachia感染率的比較

對3個雜交組合的所有后代進行PCR檢測，以確定其后代若蟲的Wolbachia感染率。為了保證PCR的準確性，每頭灰飛虱若蟲均經過2～3次PCR檢測，每個批次PCR均有清水作為陰性對照，每次瓊脂糖凝膠電泳均有DNA marker作為分子量標記。從表2看出，雌成蟲、雄成蟲均感染Wolbachia的后代，后代感染率僅為82.14%；經過四環素處理后的雌成蟲、雄成蟲后代，經檢測均未感染Wolbachia；感染雌蟲和未感染雄蟲交配所產生的后代，感染率為55.56%。

2.4 不同雜交組合后代若蟲各齡期發育歷期的比較

由表3看出，3個雜交組合產生的后代，1、2、5齡若蟲期均沒有顯著差異，但由于3、4齡若蟲期有極顯著差異，因此整個若蟲歷期表現出顯著差異；雌蟲、雄蟲全部感染和全部未感染Wolbachia的組合產生的后代，其若蟲發育歷期極顯著短于感染雌蟲和未感染雄蟲的組合（P<0.01）。

3 討論

本研究用Wolbachia的wsp基因特異性引物從3個灰飛虱地理種群中都擴增出1段599 bp的基因片段。對楚雄、南京、建湖3個地理種群灰飛虱體內Wolbachia的wsp基因序列進行比較發現，3個種群的Wolbachia具有完全相同的wsp基因序列，說明這3個種群感染的Wolbachia同屬Con株系，并未表現地理隔絕現象；但在其他昆蟲中，則報道過同種昆蟲Wolbachia存在地理隔離的現象。Sun等對中國的橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）種群中的4個Wolbachia株系的wsp基因序列比對結果表明，它們分屬于Kue、Mel、Cuc 3個類群[11]，這說明中國的橘小實蠅種群中存在的Wolbachia有地理隔絕。在本研究中，灰飛虱體內的Wolbachia同源性非常高，未表現地理隔離現象，分析其可能的原因有2個：（1）灰飛虱不同地理種群之間存在Wolbachia的橫向水平傳播；（2）灰飛虱不同地理種群間由于擴散而存在種群的交流，Wolbachia也隨之而擴散。endprint

Wolbachia作為節肢動物體內的一種內共生菌，研究得最多的就是它能引發宿主生殖異常行為，其中最普遍和常見的影響是誘導胞質不親和（CI）。在本試驗中，發現感染Wolbachia的雄性灰飛虱與未感染Wolbachia的雌性灰飛虱之間交配，所產的卵不能正常孵化，而感染Wolbachia的雌性灰飛虱與未感染Wolbachia的雄性灰飛虱之間進行交配，能夠產生后代。這一現象證明了Wolbachia對灰飛虱生殖表現出高強度的單向胞質不親和。崔建平等在室內飼養的灰飛虱群體中也發現了這種胞質不親和現象[12]。

近年來的資料表明，Wolbachia除了具有調控節肢動物宿主生殖方式的作用外，對宿主的繁殖力、生長發育速度、成活率、壽命等存在不同程度的影響。在本雜交試驗中，Wolbachia對產卵前期和卵孵化率沒有顯著影響，但對卵孵化期、有效產卵量、總產卵量有顯著影響。未感染Wolbachia的雄蟲與未感染Wolbachia的雌蟲交配產生的卵顯著多于與感染Wolbachia的雌蟲交配產生的卵；未感染Wolbachia的雄蟲與未感染Wolbachia的雌蟲交配產生的后代發育歷期極顯著短于與感染Wolbachia的雌蟲交配產生的后代歷期。這些數據表明，未感染Wolbachia的灰飛虱個體具有生殖優勢，Wolbachia 可能對宿主生殖具有負面影響。Fleury等也曾發現，果蠅（Drosophila simulan）的寄生蜂Leptopilina heterotoma工蜂被Wolbachia感染后其生殖力降低8%[13]。因為 Wolbachia 廣泛存在于宿主生殖細胞中，有可能它的存在危害了生殖細胞[14]，最終導致了感染Wolbachia的灰飛虱產卵量少于未感染的灰飛虱。

通過對3個雜交組合的后代若蟲Wolbachia的感染率進行檢測，發現了一個值得關注的現象：感染了Wolbachia的雌成蟲、雄成蟲的后代只有82.14%的感染率，并不是100%感染Wolbachia，也就是說Wolbachia的卵傳率未達到100%，這一結論與史文琦等的結論[15-16]一致，而與崔建平等提出的灰飛虱室內種群的Wolbachia經卵傳播率為100%的結論[12]相矛盾。推測可能的原因有3點：（1）與所使用的灰飛虱種群差異有關，本試驗采用的是江蘇建湖灰飛虱種群，而崔建平等采用的是云南灰飛虱種群；（2）可能是崔建平等用于檢測Wolbachia感染率的樣本數量不夠多，導致未檢測到Wolbachia；（3）與Wolbachia在宿主體內的分布部位有關，Wolbachia除了分布于灰飛虱的生殖組織外，還廣泛分布于頭、胸部肌肉、中腸、唾液腺、消化道等非生殖組織中[1]。因此筆者推測，分布于親本生殖組織的Wolbachia能100%垂直傳播給子代，而非生殖組織中的Wolbachia不能100%垂直傳播給子代，這就導致本試驗中子代灰飛虱Wolbachia的感染率低于100%。

本試驗中發現的胞質不親和現象已經被研究得很普遍，它的群體生物學和細胞學研究也有了相當的積累[17]，且一些影響CI表達的因素也得到了證實，但是其生化機理與科學應用價值尤其是生物防治方面的應用前景還需要進一步探究；另外，“Wolbachia的卵傳率未達到100%可能與Wolbachia在灰飛虱種內的垂直傳播有關”假說和“Wolbachia可能危害宿主生殖細胞”假說也需要進一步驗證，如先用熒光共焦顯微鏡對宿主體內的Wolbachia進行定位，確定是在生殖細胞中還是非生殖細胞中，再根據共生位置設計雜交試驗，以確定Wolbachia在灰飛虱種內的垂直傳播規律。這些問題的解決將會給Wolbachia在害蟲綜合治理中提供更為廣闊的前景。

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