多殺菌素對亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶和酯酶同工酶的影響

徐志紅　李俊凱

摘要：研究多殺菌素對亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶、酯酶同工酶的影響。結(jié)果表明，離體時多殺菌素不影響亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶活性，但在活體時處理48 h后顯著抑制堿性磷酸酯酶的活性；離體時多殺菌素對亞洲玉米螟酯酶同工酶活性并無影響，但是在活體時酯酶同工酶E4、E5、E6酶帶受到明顯抑制。

關(guān)鍵詞：多殺菌素；亞洲玉米螟；堿性磷酸酯酶；酯酶同工酶

中圖分類號：S435.132 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）10-0149-02

酯酶是昆蟲對殺蟲劑進(jìn)行代謝的最重要酶系之一，不同酯酶活性的升高或軛合作用的增強(qiáng)是多種昆蟲對擬除蟲菊酯和有機(jī)磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的重要原因[1-2]。在已進(jìn)行抗性研究的昆蟲中，其抗性機(jī)理幾乎涉及酯酶的代謝作用[3]，磷酸酯酶在水解有機(jī)磷農(nóng)藥和擬除蟲菊酯中起著重要作用[4]。研究開發(fā)作用機(jī)理新穎的殺蟲劑是害蟲抗性治理的最有效方法。多殺菌素（Spinosad）是一種作用機(jī)理獨(dú)特的殺蟲劑，是Spinosyn A和Spinosyn D的混合物（前者占80%，后者占20%），已經(jīng)確認(rèn)它作用于害蟲的神經(jīng)系統(tǒng)。Salgado認(rèn)為，多殺菌素作用于煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）[5]；Watson的研究表明多殺菌素也作用于γ-氨基丁酸受體（GABA）[6]；王光峰等研究了多殺菌素對甜菜夜蛾羧酸酯酶的影響，發(fā)現(xiàn)多殺菌素在離體時對羧酸酯酶無抑制作用，但在活體時能誘導(dǎo)蟲體內(nèi)羧酸酯酶活性增強(qiáng)[7]。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，Spinosyn A對辛硫磷有弱的增效作用[8]，這種增效作用可能是與有機(jī)磷代謝相關(guān)酶的活性被多殺菌素抑制所致，因此多殺菌素對堿性磷酸酯酶和酯酶同工酶影響的研究顯得尤為必要。本研究以同樣作用于GABA的阿維菌素為對照藥劑，探討Spinosyn A對亞洲玉米螟5齡幼蟲堿性磷酸酯酶、酯酶同工酶的影響，以期有助于闡明該藥劑的毒理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）按周大榮等的方法[9]室內(nèi)人工累代飼養(yǎng)，溫度（26±2） ℃，光照度2 000 lx。

1.2 試驗試劑

Spinosyn A：濃度為963%，由美國陶氏益農(nóng)公司提供原粉；對硝基苯基磷酸二鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；對硝基酚：天津化學(xué)試劑一廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取0.013 9 g對硝基酚，用1 mL丙酮溶解，加水定容至100 mL，濃度為1 mmol/L，用時再用蒸餾水稀釋1倍，即成05 mmol/L對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.2、0.4、0.6、08、1.0 mL 0.5 mmol/L對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2 mL 01 mol/L NaOH，混勻后在400 nm波長處測吸光度，重復(fù)3次，取平均值，以對硝基酚（μmol）為橫坐標(biāo)、D400 nm值為縱坐標(biāo)，繪制對硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。

1.4 試蟲處理和酶源制備

取5頭亞洲玉米螟5齡初幼蟲，用蒸餾水將體表沖洗干凈，濾紙吸干，置于5 mL 0.05 mol/L碳酸鈉緩沖液（pH值99）中勻漿30 s，于4 ℃、 3 000 r/min離心15min，取上清液作酶源。活體試驗同樣取5齡初孵幼蟲，點(diǎn)滴處理其前胸背板，每頭點(diǎn)滴1 μL以丙酮為溶劑的不同濃度的Spinosyn A藥液，對照組（CK）僅用丙酮，常規(guī)條件下飼養(yǎng)，24、48 h后取出制備酶源。

1.5 堿性磷酸酯酶活性測定方法

堿性磷酸酯酶活性測定參照邱明生等的方法[10]，略加改進(jìn)。堿性磷酸酯酶活力測定的反應(yīng)混合液為2.3 mL 0.05 mol/L 、pH值9.9碳酸鈉緩沖液，0.5 mL 7.5 mmol/L對硝基苯基磷酸二鈉和0.2 mL酶液（蛋白量約100 μg）。以 1 mg 蛋白1 min生成的對硝基酚量表示酶的比活力，單位為 nmol/（mg·min）。

1.6 Spinosyn A對亞洲玉米螟酯酶同工酶的影響

1.6.1 酶源制備 制備酶源時取10頭亞洲玉米螟5齡幼蟲，于3 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0）中冰浴整體勻漿，然后在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，紗布過濾上清液，于10 000 r/min離心10 min，取上清液作酶源備用。離體酶活性試驗藥劑處理同上，處理后按酶源 ∶ 40%蔗糖 ∶ 0.03%溴酚藍(lán)=2 ∶ 1 ∶ 1混勻，迅速點(diǎn)樣進(jìn)行電泳。

1.6.2 酯酶同工酶電泳 凝膠制備和電泳檢測參照慕立義的方法[11]，并略有修改。分離膠濃度采用10%，縮膠濃度為25%，用垂直板狀電泳于冰箱中電泳，電壓150 V，起始電流10 mA，待指示劑前緣進(jìn)入濃縮膠，電流加大并恒定于20 mA，樣品蛋白量30 μg，電泳結(jié)束后以乙酸-α-萘酯為底物、以堅牢蘭B為顯色劑，37 ℃水浴染色15 min，然后用7%冰乙酸脫色、固定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Spinosyn A對亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶離體和活體活性的影響

不同濃度的Spinosyn A對亞洲玉米螟5齡幼蟲堿性磷酸酯酶離體和活體活性影響如表1、表2所示。

由表1可知，從Spinosyn A對亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶的抑制率上看，各處理組與對照組相比都有微弱的激活，但各處理組之間無太大差異，這表明Spinosyn A對亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶離體活性雖有影響，但Spinosyn A并不直接作用于亞洲玉米螟堿性磷酸酯酶。

由表2可以看出，經(jīng)Spinosyn A處理24 h之后，處理組與對照組的堿性磷酸酯酶比活力都有了明顯變化，低濃度時（0.1 μmol/L）堿性磷酸酯酶被誘導(dǎo)活化，而在高濃度時（1 μmol/L）相對于對照組其堿性磷酸酯酶被明顯抑制。對照藥劑阿維菌素同樣也表現(xiàn)出在低濃度時其堿性磷酸酯酶被激活，高濃度時被抑制的特性。經(jīng)Spinosyn A、阿維菌素處理48 h之后，處理組的堿性磷酸酯酶比活力有了新的變化，所有處理組都表現(xiàn)出抑制作用，高濃度藥劑比低濃度的抑制率要高些，方差分析的結(jié)果表明，所有處理組的比活力與對照組間差異顯著。endprint

2.2 Spinosyn A對亞洲玉米螟酯酶同工酶的影響

圖1、圖2分別為Spinosyn A對亞洲玉米螟離體、活體酯酶同工酶的電泳圖。由圖1可知，在離體條件時Spinosyn A、阿維菌素與對照組相比，其電泳酶帶都沒有明顯差別，說明在離體時酯酶同工酶的活性并不受到抑制。

由圖2可知，處理24 h后，0.1 μmol/L的Spinosyn A處理組與對照組比，E6受到弱的抑制作用，其余酶帶無明顯差異；而0.1、1 μmol/L阿維菌素的E6酶帶與對照組相比皆有明顯抑制。在處理48 h的酶帶圖中，濃度為0.1 μmol/L的Spinosyn A組的E4、E5酶帶都明顯變?nèi)酰珽6酶帶也有減弱，1 μmol/L的Spinosyn A處理組與對照組無明顯差異；而0.1、1 μmol/L阿維菌素處理組的E4、E5酶帶都有強(qiáng)的減弱，1 μmol/L處理組的E6酶帶完全消失，表明受到了強(qiáng)的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

磷酸酯酶廣泛存在不同種類昆蟲中，是昆蟲體內(nèi)的一種

主要的代謝解毒酶，它們參與中間代謝，對昆蟲的生長發(fā)育起著重要作用。磷酸酯酶包括磷酸三酯水解酶和磷酸二酯水解酶，前者包括芳基酯水解酶和O-烷解水解酶，分別可使有機(jī)磷脫去芳基和O-烷基，而后者主要是使脫烷基的磷酸酯產(chǎn)生水解[12]。本研究的結(jié)果表明，在離體條件時，Spinosyn A對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶并無抑制作用；但是在活體條件時，處理24 h后就出現(xiàn)在低濃度（0.1 μmol/L）時激活堿性磷酸酯酶的活性，而在高濃度時（1 μmol/L）抑制其活性，在處理48 h后則2種濃度下都表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這說明雖然Spinosyn A對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶沒有直接作用，但是它能通過間接的途徑影響堿性磷酸酯酶的活性，最終表現(xiàn)出對堿性磷酸酯酶的抑制作用，這大概也是其在昆蟲體內(nèi)降解緩慢的原因之一。同時，在活體條件下Spinosyn A 對亞洲玉米螟幼蟲體內(nèi)的堿性磷酸酯酶的抑制與筆者所在課題組前期研究結(jié)果[8]是一致的，可能是多殺菌素對辛硫磷增效的原因之一。至于Spinosyn A在活體條件下是通過何種方式抑制堿性磷酸酯酶的活性有待于進(jìn)一步研究。

亞洲玉米螟的酯酶同工酶電泳酶帶結(jié)果表明，在離體時Spinosyn A并不影響酯酶同工酶；在活體時，E6受到一定程度的抑制。阿維菌素也同樣對E6酶帶有抑制作用，表明這2種大環(huán)內(nèi)酯化合物都能抑該酶的活性。至于這個酶帶具體是什么酶、有什么特點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lee S H，Clark J M. Permethrin carboxylesterase functions as nonspecific sequestration proteins in the Hemolymph of Colorado potato beetle[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，1998，62（1）：51-63.

[2]Zhu K Y，Gao J R. Kinetic properties and variability of esterases in organophosphate-susceptible and -resistant greenbugs，Schizaphis graminum （Homoptera：Aphididae）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology ，1998，62（2）：135-145.

[3]唐振華，我國昆蟲抗藥性研究的現(xiàn)狀及展望[J]. 昆蟲知識，2000，37（2）：97-103.

[4]趙善歡. 昆蟲毒理學(xué)[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993.

[5]Salgado V L. The mode of action of spinosad and other insect control products[J]. Down to Earth，1997（52）：35-44.

[6]Watson G B. Actions of insecticidal spinosyns on aminobutyric acid responses from small-diameter cockroach neurons[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2001，71（1）：20-26.

[7]王光峰，張友軍，柏連陽，等. 多殺菌素對甜菜夜蛾多酚氧化酶和羧酸酯酶的影響[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2003，5（2）：40-46.

[8]徐志紅，蔣志勝. Spinosyn A對家蠅GSTs的影響及其對辛硫磷的增效作用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：62-63，65.

[9]周大榮，王玉英，劉寶蘭，等. 玉米螟人工大量繁殖研究：Ⅰ.一種半人工飼料及其改進(jìn)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，1980，7（2）：113-122.

[10]邱明生，王進(jìn)軍，趙志模，等. 輻射對亞洲玉米螟體內(nèi)幾種水解酶活力的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，1999，26（4）：319-323.

[11]慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：162-163.

[12]Matsumura F，Ghiasuddin S M. Characteristics of DDT-sensitive Ca-ATPase in the axonic membrane[M]//Narahashi T. Neurotoxicology of Insecticides and Pheromones. New York：Plenum Press，1979：245-257.李建文，高易宏，吳 輝，等. 生防菌BS04防治辣椒疫病機(jī)制[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：151-153.endprint