生防菌BS04防治辣椒疫病機(jī)制

李建文　高易宏　吳輝　江翱　孫文秀

摘要：從生防菌的根際定殖、防效和誘導(dǎo)防御酶活性3個(gè)方面探討了生防菌BS04防治辣椒疫病的機(jī)制。結(jié)果表明，生防菌BS04能夠在辣椒根際定殖，且定殖密度比較穩(wěn)定，穩(wěn)定維持在105 CFU/g以上；盆栽試驗(yàn)測(cè)定防治效果表明，生防菌BS04的培養(yǎng)液對(duì)辣椒幼苗期疫病有較明顯的防治效果，防效達(dá)85.81%；防御酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，接種辣椒疫霉菌后，辣椒葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的活性均顯著提高并出現(xiàn)峰值，但生防菌BS04培養(yǎng)液和辣椒疫霉菌共同處理后，各種防御酶的活性有所降低，并表現(xiàn)出相對(duì)平緩的狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：生防菌；辣椒疫病；防病機(jī)制；生物防治；防御酶

中圖分類號(hào)： S436.418.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0151-03

辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起，是辣椒生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生比較嚴(yán)重的土傳病害[1-3]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用化學(xué)藥劑[4]、選育抗病品種[5]、生物防治[6]等措施不斷加強(qiáng)對(duì)辣椒疫病的防治。但由于辣椒疫霉菌變異能力強(qiáng)，致病力分化明顯，容易產(chǎn)生抗藥性，采用化學(xué)藥劑和選育抗病品種防治辣椒疫病存在極大的弊端。利用有益微生物防治辣椒疫病成為首選的有效措施，越來(lái)越多的生防菌也受到了人們的關(guān)注。目前，已從土壤及植物等不同來(lái)源分離篩選到若干株對(duì)辣椒疫霉菌具有拮抗作用的生防菌[7-14]，但對(duì)其防病機(jī)制的研究還不夠深入。筆者從辣椒根際土壤中分離篩選到對(duì)辣椒疫霉菌具有較強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)其他幾種病原菌具有拮抗作用的生防菌BS04（待發(fā)表）。為進(jìn)一步明確生防菌BS04對(duì)辣椒疫病的防治效果，本試驗(yàn)對(duì)該菌株在辣椒根際的定殖、對(duì)辣椒疫病的防效及對(duì)辣椒葉片防御酶系的活性影響進(jìn)行了研究，為更深入探討其防病機(jī)制提供資料和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

供試菌株BS04為筆者所在實(shí)驗(yàn)室從辣椒根際土壤中分離獲得的對(duì)辣椒疫霉菌等多種植物病原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的生防細(xì)菌。經(jīng)形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。辣椒疫霉菌為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）用于培養(yǎng)菌株BS04，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）用于培養(yǎng)辣椒疫霉菌，胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）用于辣椒疫霉菌產(chǎn)孢。

1.2 抗卡那霉素突變株的篩選

將BS04菌株接種到NA培養(yǎng)基平板上，待長(zhǎng)出菌落后用紫外線照射30 s，再將其轉(zhuǎn)接到卡那霉素濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL的NA平板上，直到篩選出抗2.0 μg/mL卡那霉素并對(duì)病原菌的拮抗作用保持不變的BS04突變株。

1.3 BS04菌株在辣椒根際的定殖

將卡那霉素抗性BS04突變株接種至卡那霉素2.0 μg/mL的NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，配制成濃度為2×108 CFU/mL的菌懸液。將生長(zhǎng)至6葉期的辣椒幼苗在上述菌懸液中浸根1 h后移栽至盆缽中，溫室中管理，每隔7 d取樣檢測(cè)BS04菌株在辣椒根際的定殖情況。測(cè)定方法如下：輕輕拔出辣椒幼苗，清水沖洗根部，并用吸水紙吸去根表水，剪下根系，稱質(zhì)量，研磨，無(wú)菌水稀釋，涂在含有卡那霉素的NA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)算菌落的數(shù)量。

1.4 BS04菌株對(duì)辣椒疫病的防效

選取6葉期的健康辣椒幼苗60株，每盆（直徑10 cm）1株，平均分為2組。一組將濃度為2×108 CFU/mL的BS04菌懸液20 mL澆灌到栽有辣椒幼苗的盆缽中，7 d后采用灌根法接種辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液（5×103個(gè)/mL）10 mL；另一組以無(wú)菌水處理為對(duì)照，7 d后用辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液（5×103個(gè)/mL）10 mL灌根。10 d后調(diào)查病情指數(shù)，參照 Hartman 的方法進(jìn)行辣椒疫病病情分級(jí)，并計(jì)算防治效果。

1.5 BS04菌株處理后辣椒葉片SOD、POD、PPO和PAL酶活性測(cè)定

選取室內(nèi)盆栽的6葉期健康辣椒苗，設(shè)如下4個(gè)處理：①噴霧接種BS04菌株培養(yǎng)液（含菌量約為108 CFU/mL）；②噴霧BS04菌株培養(yǎng)液（濃度同①）和辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液（103個(gè)/mL）；③噴霧接種辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液（103個(gè)/mL）；④清水。每個(gè)處理重復(fù)3次。分別于處理后1、2、3、4、5、6、7 d取樣，制得過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的粗酶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩OD活性測(cè)定采用NBT光還原法[15]；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[15]；PPO活性測(cè)定采用鄰苯二酚法[15]；PAL活性測(cè)定采用分光光度法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BS04菌株在辣椒根際的定殖

采用菌液浸根的方法對(duì)生防菌BS04在辣椒根際的定殖情況進(jìn)行分析，結(jié)果（表1）表明，BS04菌株能夠在辣椒根際定殖，且定殖密度比較穩(wěn)定，處理后7 d時(shí)定殖密度是5.89×105 CFU/g，處理后35 d時(shí)定殖密度是5.12×105 CFU/g，均穩(wěn)定維持在105 CFU/g以上。

2.2 BS04菌株對(duì)辣椒疫病的防治效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，生防菌BS04的培養(yǎng)液對(duì)辣椒幼苗期疫病有較明顯的防治效果。辣椒幼苗在接種病原菌后7 d開始發(fā)病，根莖部出現(xiàn)變黑癥狀，10 d后調(diào)查病情指數(shù)及防效，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌水處理的辣椒幼苗全部發(fā)病，甚至死亡；而生防菌BS04處理后的辣椒幼苗仍有大量存活，表現(xiàn)輕微發(fā)病，防效達(dá)到85.81%。

2.3 BS04菌株處理后辣椒葉片SOD、POD、PAL和PPO酶活性的變化endprint

采用不同方式處理辣椒幼苗后，其葉片各防御酶活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，用BS04培養(yǎng)液和清水處理后，辣椒葉片各防御酶活性的變化相對(duì)比較平穩(wěn)；而單獨(dú)接種病原菌和接BS04培養(yǎng)液后再接種病原菌的2個(gè)處理，除SOD酶活性變化較平緩?fù)猓渌?種防御酶活性出現(xiàn)較大變化。此外，SOD、POD和PAL 3種酶活性變化的趨勢(shì)基本相同，而PPO酶活性的變化則與其不同。與采用BS04培養(yǎng)液和清水處理相比較，單獨(dú)接種病原菌和BS04+病原菌的處理表現(xiàn)出較高的防御酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)接種病原菌后辣椒葉片的防御酶活性比BS04+病原菌處理后的活性要高一些，這可能與只接種病原菌能夠誘導(dǎo)酶活性的提高，而生防菌BS04可以抑制病原菌的生長(zhǎng)導(dǎo)致酶活性降低有一定的關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SOD、POD和PAL 3種防御酶在接種病原菌和BS04+病原菌處理后3 d時(shí)酶活性達(dá)到峰值，而PPO酶活性則與之不同，在處理后 5 d 時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，然后隨時(shí)間推移不斷降低。

3 討論

植物病害生物防治是指利用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)作物病害進(jìn)行有效防治的技術(shù)和方法。其防病機(jī)制主要包括分泌抗菌物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性及促進(jìn)植株生長(zhǎng)增強(qiáng)植株抗逆性4個(gè)方面。研究表明，菌株能否在宿主植物體內(nèi)或根際土壤中定殖，對(duì)生防菌的防病效果具有重要影響[17]。更多學(xué)者認(rèn)為誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗性在生防菌的防病過(guò)程中起主要作用[18]，并進(jìn)行了大量研究。枯草芽孢桿菌作為目前研究較多、應(yīng)用較為廣泛的生防菌，對(duì)其防病機(jī)制的研究報(bào)道較多，但對(duì)土傳病害辣椒疫病的防病機(jī)制系統(tǒng)研究較少。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌BS04對(duì)辣椒疫霉菌具有較強(qiáng)拮抗作用，能夠明顯抑制菌絲生長(zhǎng)，并在辣椒根際穩(wěn)定定殖，對(duì)辣椒疫病也有較高的防治效果。本試驗(yàn)中采用單獨(dú)接種辣椒疫霉菌和BS04+辣椒疫霉菌處理后，均較好地誘導(dǎo)了辣椒

幼苗葉片內(nèi)SOD、POD、PAL和PPO防御酶的活性，這與前人的研究結(jié)果[19-20]基本一致。SOD和POD是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的保護(hù)酶，同時(shí)POD可催化酚類物質(zhì)的前體聚合成木質(zhì)素，增強(qiáng)寄主的抵抗性。PAL是酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，病原菌侵染后會(huì)激發(fā)寄主植物的PAL活性提高。PPO可以將酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì)，對(duì)外來(lái)的病原菌產(chǎn)生抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，上述防御酶活性的增強(qiáng)，提示了辣椒抗病性的提高，但也發(fā)現(xiàn)生防菌BS04和辣椒疫霉菌混合接種后辣椒葉片防御酶活性比僅接種病原菌要低一些，這可能與BS04菌株和病原菌相互作用有一定的關(guān)系，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]周啟明，李林英，楊淑華. 辣椒疫病的調(diào)查研究[J]. 中國(guó)蔬菜，1984（1）：40-43.

[2]Hwang B K，Kim C H. Phytophthora blight of pepper and its control in Korea[J]. Plant Dis，1995，79：221-227.

[3]Hausbeck M K，Lamour K H. Phytophthora capsici on vegetable crops：research progress and management challenges[J]. Plant Disease，2004，88（12）：1292-1303.

[4]李 帥，王滿意，王紅學(xué)，等. N-（3，5-二甲氧基-4-烷氧基苯乙基）扁桃酰胺類殺菌劑的設(shè)計(jì)合成及殺菌活性[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（1）：17-23.

[5]曾 莉，曹必好，徐小萬(wàn)，等. 辣椒抗疫病遺傳與育種的最新研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（12）：174-177.

[6]楊琦瑤，索雅麗，郭榮君，等. 枯草芽孢桿菌B006對(duì)黃瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（2）：235-242.

[7]尹敬芳，張文華，李健強(qiáng)，等. 辣椒疫病生防菌的篩選及其抑菌機(jī)制初探[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（1）：88-94.

[8]馬曉飛，劉長(zhǎng)遠(yuǎn)，趙奎華，等. 辣椒疫病生防菌株鑒定及控病機(jī)理研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（10）：136-141.

[9]何延靜，劉海明，胡洪波，等. 一株拮抗辣椒疫霉的假單胞菌的分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2006，46（4）：516-521.

[10]梅新蘭，趙青云，譚石勇，等. 辣椒疫病拮抗菌株篩選、鑒定及其防效[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，21（10）：2652-2658.

[11]袁樹忠，周明國(guó). 辣椒疫病生物防治菌株的篩選與定殖[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2006，27（4）：93-97.

[12]楊瑞先，陶玉鳳，宋美仙，等. 銀杏內(nèi)生細(xì)菌防治辣椒疫病研究[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（4）：552-559.

[13]Lim J H，Kim S D. Biocontrol of phytophthora blight of red pepper caused by Phytophthora capsici using Bacillus subtilis AH18 and B. licheniformis K11 formulations[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2010，53（6）：766-773.

[14]Lee K J，Kamala-Kannan S，Sub H S，et al. Biological control of Phytophthora blight in red pepper （Capsicum annuum L.） using Bacillus subtilis[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（7）：1139-1145.

[15]高俊鳳. 植物生理學(xué)技術(shù)（四） [M]. 西安：世界圖書出版社西安公司，2000.

[16]薛應(yīng)龍. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985：138-139.

[17]郭堅(jiān)華，龔龍英，祁紅英，等. 三個(gè)拮抗菌株對(duì)辣椒青枯病的作用機(jī)制[J]. 中國(guó)生物防治，2003，19（1）：6-10.

[18]van Peer R，Niem ann G J，Schippers B. Induced resistance and phytoalex in accum ulation in biological control of Fusarium wilt of carnaion by Pseudomonas sp.strain WCS417[J]. Phytopathology，1991，81：728-734.

[19]柳 鳳，歐雄常，何 紅，等. 紅樹內(nèi)生細(xì)菌RS261防治辣椒疫病機(jī)理的初步研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2010，40（1）：74-80.

[20]邱思鑫，何 紅，阮宏椿，等. 內(nèi)生芽孢桿菌TB2防治辣椒疫病效果及其機(jī)理初探[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2004，34（2）：173-179.楊 洋，胡永紅，楊文革，等. 多抗菌素發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：154-158.endprint