一種便捷高產的辣椒疫霉菌游動孢子產生方法

許亞池+王述彬+刁衛(wèi)平+劉金兵+潘寶貴+郭廣君+戈偉+劉娜

摘要：辣椒疫霉菌游動孢子的形成是辣椒疫病發(fā)生的前提，疫霉菌產孢條件的優(yōu)化對辣椒疫病抗性育種具有重要意義。本試驗對V8培養(yǎng)基的濃度、黑暗培養(yǎng)時間及無菌水處理等條件進行探索，以期獲得辣椒疫霉菌游動孢子產生的最佳條件。結果表明：5% V8培養(yǎng)基最適合辣椒疫霉菌菌絲生長及產孢，產孢量可達100萬個/mL，在光照試驗中發(fā)現(xiàn)5 d黑暗處理時菌絲生長濃密且在光照條件下易于產孢。結果還發(fā)現(xiàn)，無菌水對產孢量有重要作用，黑暗處理后加入適量無菌水進行光照能夠大大提高產孢量，最高產孢量可達750萬個/mL。本試驗簡化了辣椒疫霉菌的培養(yǎng)，獲得了游動孢子最佳產孢條件，為辣椒抗疫霉病研究奠定了基礎。

關鍵詞：辣椒；疫霉菌；游動孢子；產孢條件

中圖分類號：S436.418.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0172-02

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）所引起的世界性病害，可造成幼苗猝倒、莖稈枯死和果實腐爛。辣椒疫霉菌最早由美國學者 Leonian于 1922 年分離并定名為Phytophthora capsici[1]，屬鞭毛菌亞門（Mastigomycotina ）卵菌綱（Oomycetes） 霜霉目（Peronosporales）疫霉屬（Phytophthora）真菌[2]。辣椒疫病于1918年在美國首次發(fā)生后并迅速傳播至整個世界，我國也于20世紀50年代在江蘇發(fā)現(xiàn)辣椒疫病的發(fā)生[3]。目前在我國各地均有發(fā)生，是我國辣椒生產上的主要病害之一。在辣椒種質資源疫病抗性評價與抗性相關基因表達及克隆等相關研究中，需要預先誘發(fā)出大量疫霉菌游動孢子作為接種菌源，而對辣椒疫霉菌產孢條件和游動孢子釋放條件的優(yōu)化是上述研究的前提。鑒于目前辣椒疫霉菌培養(yǎng)及產胞條件研究結論復雜多樣，還未有一致的標準和方法，本試驗選用混合蔬菜汁配制的改良V8培養(yǎng)基，對辣椒疫霉病菌絲培養(yǎng)和產胞過程中的光照、水分等因素進行研究，探索辣椒疫霉菌最佳產孢條件，旨在簡化辣椒疫霉菌培養(yǎng)及游動孢子產生過程，為辣椒疫病抗性育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的辣椒疫霉菌來自江蘇省農業(yè)科學院資源與環(huán)境研究所，金寶湯V8 100%混合蔬菜汁飲料購于金寶湯亞洲有限公司。

基本培養(yǎng)基：瓊脂粉10 g+碳酸鈣1.0 g，加蒸餾水定容至500 mL，120 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 V8培養(yǎng)基配比對菌絲生長及產孢影響 配制5%、10%、15%、20%等4種濃度的V8培養(yǎng)基，編號為1、2、3、4，以基本培養(yǎng)基作為空白對照組，編號為0，每組3次重復。將供試辣椒疫霉菌切塊轉接到上述5種培養(yǎng)基上，置于28 ℃暗培養(yǎng)5 d后記錄菌落直徑，再移至28 ℃全光照條件下培養(yǎng) 5 d，10倍顯微鏡下觀察孢子囊，記錄孢子囊數，然后誘導孢子囊釋放游動孢子并計算濃度。

1.2.2 黑暗培養(yǎng)時間對菌絲生長及產孢影響 將辣椒疫霉菌接種于5%V8培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，設置3、4、5、6 d黑暗處理，編號為3、4、5、6，以全光照作為空白對照，編號為0，每組3次重復。培養(yǎng)后3 d開始依照試驗設置將黑暗處理的培養(yǎng)皿移到全光照條件下，培養(yǎng)后6 d時記錄菌落直徑，10 d 后在10倍顯微鏡下觀察孢子囊，記錄孢子囊數，然后誘導游動孢子囊釋放游動孢子并計算濃度。

1.2.3 水處理對產孢影響 取28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后的疫霉菌，以全光照不加無菌水為對照組，以全光照加入10 mL無菌水為處理組，每組3個重復。5 d后誘導孢子囊釋放游動孢子并計算濃度。

1.2.4 菌落直徑數據統(tǒng)計 菌落直徑（cm）=3個培養(yǎng)皿菌落直徑之和/3。

1.2.5 疫霉菌孢子囊數據統(tǒng)計 10倍顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察記錄孢子囊數并求出1個視野的平均孢子囊數：1個視野的平均孢子囊數（個）=10個視野總孢子囊數/10。

1.2.6 誘導孢子囊釋放游動孢子及其濃度計算 在培養(yǎng)皿內加入10 mL無菌水，4 ℃冰箱處理30 min，取出置于室溫 30 min，沖洗下白色菌落，吸取等量孢子懸浮液，10倍顯微鏡下利用25×16規(guī)格血球計數板統(tǒng)計并計算游動孢子濃度：游動孢子濃度（個/mL）=5個中方格內游動孢子數/80×400×10 000。

2 結果與分析

2.1 V8培養(yǎng)基配比對菌絲生長及產孢影響

辣椒疫霉菌5 d黑暗培養(yǎng)5 d光照培養(yǎng)后在顯微鏡10倍視野下鏡檢，發(fā)現(xiàn)0號偶爾有孢子囊出現(xiàn)在視野中，菌絲短而稀疏；1號5%V8試驗組菌絲較密，接種塊中央附近孢子囊出現(xiàn)較少，邊緣孢子囊多，1個視野中平均有50個邊緣孢子囊；2號10%試驗組、3號15%試驗組平均20、40個；4號20%試驗組的中央、邊緣孢子囊個數差異不明顯，1個視野中平均3個孢子囊。菌落直徑與血球計數板所得游動孢子濃度見圖1。由圖1可以看出，1號5%V8培養(yǎng)基最有利于辣椒疫霉菌菌絲生長與產孢。

2.2 黑暗處理時間對辣椒疫霉菌菌絲生長及產孢的影響

辣椒疫霉菌經過0、3、4、5、6 d黑暗處理后在培養(yǎng)后10 d 于10倍顯微鏡下鏡檢，結果發(fā)現(xiàn)，0 d處理菌絲稀少，稀疏地在培養(yǎng)基上生長，1個視野中平均2個孢子囊；3 d處理菌絲稀疏，1個視野中平均4個孢子囊；4 d處理菌絲較3 d處理濃密，1個視野中平均90個孢子囊；5 d處理菌絲成棉絮狀，但邊緣較少，1個視野中平均140個孢子囊；6 d處理菌絲與5 d處理差異不大，但1個視野中平均15個孢子囊。由圖2可以看出，在3 d黑暗處理中辣椒疫霉菌雖然菌落直徑最大，但其菌絲較5 d黑暗培養(yǎng)的菌絲不夠濃密，并且光照處理后產孢效果沒有5 d黑暗培養(yǎng)的強，綜合選擇5 d黑暗培養(yǎng)作為最佳黑暗培養(yǎng)時間。endprint

2.3 全光照時加入無菌水對游動孢子釋放的影響

辣椒疫霉菌經過5 d黑暗培養(yǎng)和5 d光照培養(yǎng)后與奧林巴斯顯微鏡10倍視野下觀察（圖3、圖4），經血球計數板計數得到加入無菌水的游動孢子濃度高達750萬個/mL，未加入無菌水的游動孢子濃度為50萬個/mL。在加入無菌水的試驗組中發(fā)現(xiàn)，孢子囊一旦成熟就會在水的作用下釋放游動孢子，游動孢子聚集在菌絲附近形成游動孢子樹的現(xiàn)象（圖5）。

3 結論與討論

在以往的研究中，對辣椒疫霉菌產孢所適宜的培養(yǎng)基和

誘導方法存在不同觀點。王曉敏等發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜培養(yǎng)基適合辣椒疫霉菌菌絲生長和游動孢子囊產生[4-6]；劉正坪等研究發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯+番茄、PV8上疫霉菌菌絲生長狀況最佳[7]；而徐作珽等認為V8培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，能很好地促進辣椒疫霉菌孢子囊的產生，V8培養(yǎng)基較利馬豆培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基、PDA等具有營養(yǎng)元素穩(wěn)定、制作簡單方便等優(yōu)點[8]。本研究在有關V8培養(yǎng)基對辣椒疫霉菌培養(yǎng)的報道介紹下，利用V8混合蔬菜汁來配制不同濃度的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)5%配比最有利于菌絲生長及產孢。

張政兵等發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌菌絲生長對光照不敏感，但孢子囊的產生需要光照[9]。有學者認為在光照培養(yǎng)誘導產孢之前需要黑暗培養(yǎng)，該過程作用是為辣椒疫霉菌產孢積累營養(yǎng)物質，但對于黑暗培養(yǎng)的時間還未見研究。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，光照處理相對黑暗處理有抑制菌絲生長的現(xiàn)象，導致在全光照下培養(yǎng)的菌落直徑較小，氣生菌絲稀疏；并且發(fā)現(xiàn)菌落直徑與產孢量并不存在正相關關系，菌落直徑大的產孢量不一定大；本試驗在辣椒疫霉菌產孢需要光照這一觀點上與前人結論一致。在光照培養(yǎng)誘導產孢之前需要黑暗培養(yǎng)，先增加疫霉菌的營養(yǎng)生長，王曉敏推測可能由于營養(yǎng)生長積累了為產生孢子所需的養(yǎng)分，但過分生長是不利于產孢的[4]。本試驗為探索黑暗培養(yǎng)時間進行比較試驗，得出5 d黑暗處理的效果最好，菌絲生長濃密，光照培養(yǎng)后產孢較多。

辣椒疫霉菌孢子囊在16～28 ℃下多為間接萌發(fā)，即在水中孢子囊萌發(fā)釋放游動孢子，在30 ℃以上時多為直接萌發(fā)，即在濕度較低時，孢子囊萌發(fā)產生芽管[10]。辣椒疫霉菌侵染寄主的典型過程是通過游動孢子完成侵染的，所以研究水對于游動孢子產生及釋放的影響具有重要意義。侯全剛等一致認為，連續(xù)光照有利于辣椒疫霉菌產孢[11-12]，但在全光照條件下是否加無菌水培養(yǎng)少有研究，本研究得出水對游動孢子的釋放有重要作用，與未加無菌水對照組相比游動孢子濃度高出1個數量級。簡化游動孢子釋放程序是本研究最大的創(chuàng)新，選擇V8混合蔬菜汁來代替單一培養(yǎng)基，加之研究水對產孢影響得出最簡化的產孢條件，增加了游動孢子的釋放量，為辣椒疫病研究奠定了基礎。

參考文獻：

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