2012年河北省圍場縣馬鈴薯晚疫病菌表型及基因型分析

何佳昱　丁明亞　楊志輝　朱杰華

摘要：對2012年采自河北省圍場縣永和棧、銀窩溝、克勒溝、小葦子溝、扣花營5個地點的60株晚疫病菌測定了其交配型、甲霜靈抗性、mtDNA單倍型、SSR基因型，結果表明，60株晚疫病菌全部為A1交配型，甲霜靈高抗菌株58株，占96.67%；敏感菌株2株，占3.33%。采用以PCR方法為基礎的mtDNA單倍型檢測新方法共鑒定出ⅠR3、ⅡR3、ⅡR2 3種mtDNA單倍型。其中，ⅠR3單倍型為該群體的優勢單倍型，占80.0%；ⅡR3、ⅡR2 分別占18.3%、1.7%。同時，還利用具有多態性的8對引物測定了該群體的SSR基因型，共檢測到18個等位基因、5種基因型。SSR聚類結果表明，SSR基因型與菌株對甲霜靈抗性有一定相關性，而與交配型和地理來源無相關性。圍場縣晚疫病菌群體結構比較單一，遺傳多樣性程度較低。

關鍵詞：致病疫霉；甲霜靈抗性；mtDNA單倍型；SSR基因型

中圖分類號： S435.32 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0179-04

河北省圍場縣是中國人民共和國農業部命名的第一批國家級馬鈴薯生產基地縣，是“中國馬鈴薯之鄉”，馬鈴薯年種植面積穩定在 30 000 hm2，年產鮮薯5億～6億kg，年產值 3 000萬～4 000萬元[1]。由于馬鈴薯晚疫病的發生與流行，馬鈴薯產量損失約 4 500 kg/hm2，經濟損失超過2 000元/hm2[2]。晚疫病的發生與流行和病菌群體遺傳結構變化有密切聯系[3-5]。了解一個區域晚疫病菌的群體結構是制定該地區晚疫病防控技術的理論基礎。2000年，朱杰華等在圍場縣首次發現了晚疫病菌A2交配型[6]。2002年，王文橋等在圍場縣再次發現A2交配型，但之后檢測中并未發現A2交配型[7-8]。2006年，姚國勝等報道，圍場縣甲霜靈高抗菌株占被測菌株的88.5%[9]。2012年，王文橋等發現，河北省甲霜靈抗性菌株所占比例由2007年的100%降為2008年的664%，2009年又回升為74.2%[8]。為了更好地揭示晚疫病的群體結構、動態變化，國內學者采用了分子技術對其進行研究[10]。2000年，朱杰華等采用RAPD方法研究了DNA多態性與A2交配型之間的關系，認為兩者之間具有一定的相關性，各地的晚疫病菌系出現不同程度的群體分化現象[11]。2008年，楊志輝等利用12對AFLP引物組合對1996—2002年采自河北省的晚疫病菌菌株進行PCR擴增，結果表明，群體結構比較簡單，遺傳多樣性較低[12]。姚國勝等首次利用SSR標記研究晚疫病菌的基因型結構，利用Pi4B、Pi4G 2對引物于河北省47株馬鈴薯晚疫病菌中鑒定出4個SSR基因型，并發現1種新的基因型F-06[13]。2009年，陳良華對1997—2007年采自圍場縣的致病疫霉菌株mtDNA進行單倍型測定，僅發現Ⅱa 1種單倍型[10]。本研究測定2012年圍場縣晚疫病菌群體的表型、基因型，明確當前該地區晚疫病菌群體結構，與以前群體的性狀進行比較，了解圍場縣晚疫病菌群體的動態變化，為圍場縣馬鈴薯晚疫病防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2012年在圍場縣永和棧、銀窩溝、克勒溝、小葦子溝、扣花營等5個地點共采集并分離60株單病斑馬鈴薯晚疫病菌。

1.1.2 供試藥劑 98%甲霜靈原藥由河北省雙吉化工有限公司提供，二甲亞砜（DMSO）由北京博奧拓達科技有限公司生產。

1.1.3 供試培養基 黑麥培養基：黑麥60 g，蔗糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 交配型測定 采用對峙培養法將供試菌株與A1、A2交配型標準菌株分別接種在黑麥培養基平板上，置于18 ℃生化培養箱中黑暗培養，顯微鏡觀察菌落交界處是否出現卵孢子。若待測菌株與A1產生卵孢子，則待測菌株為A2交配型；若待測菌株與A2產生卵孢子，則待測菌株為A1交配型[14]。

1.2.2 甲霜靈敏感性測定 將供試菌株分別接種在含甲霜靈0、5、100 μg/mL的黑麥培養基平板中央，置于18 ℃生化培養箱中黑暗培養，待對照菌落直徑大于50 mm時，參照Lee等的方法[15]測量并記錄菌株甲霜靈敏感性。

1.2.3 mtDNA單倍型測定 采用Yang等的方法[16]對供試菌株的2個高變區即 HVRi、 HVRii進行PCR擴增，引物序列見表1。對致病疫霉線粒體2個高變區多態性片段進行分析，致病疫霉存在6種線粒體單倍型即 ⅠR1、ⅠR2、ⅠR3、ⅡR1、ⅡR2、ⅡR3。

1.2.4 SSR基因型測定 選取8對具有多態性的微衛星標記測定晚疫病菌SSR基因型，即張宏磊等開發的5對引物（I-07111、I-07122、F5-22735、E-14923、E-17965）[17]和Li等開發的3對引物（D13、PinfSSR8、PinfSSR4）（表2）[18]。

2 結果與分析

2.1 交配型測定

2012年圍場縣采集的60株晚疫病菌交配型組成單一，均為A1交配型，未發現A2交配型或自育型菌株，表明圍場縣馬鈴薯主產區發生有性生殖的可能性很小。

2.2 甲霜靈敏感性測定

甲霜靈敏感性測定結果顯示，圍場縣60株致病疫霉中，抗性菌株占絕對優勢。高抗菌株58株，占96.67%；無中抗菌株；敏感菌株2株，占3.33%。2株敏感菌株分別是JW12-25、JW12-59，分別采自克勒溝、銀窩溝，由此可知，克勒溝、銀窩溝地致病疫霉群體仍有很少比例的甲霜靈敏感菌株存在，而其他采集地可能全部為抗性菌株。

2.3 mtDNA單倍型分析

以mtDNA單倍型方法對60株致病疫霉共鑒定出ⅠR3（泳道1、2、5、6、7、10）、ⅡR2（泳道4）、ⅡR3（泳道3、8、9）3種單倍型，瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。mtDNA單倍型在致病疫霉群體中的分布比率如圖2所示，從高變區HVRi來看以Ⅰ型為主，占80%；從高變區HVRii來看，R3型占絕對優勢，占98%，R2型僅占2%，無R1型。從2個高變區HVRi、HVRii組合來看，48株致病疫霉mtDNA單倍型為ⅠR3，占800%；11株單倍型為ⅡR3，占18.33%；僅檢測到1株單倍型為ⅡR2，占1.67%。endprint

由圖3可知，永和棧、銀窩溝、克勒溝、小葦子溝、扣花營等5個采樣點中，ⅠR3分布最廣，在每個采樣點都有分布，且絕大多數都是該地區的優勢線粒體單倍型。ⅡR3分布也很廣，除小葦子溝未發現外，其他4個采樣點都有發現。ⅡR2僅在克勒溝發現了1株。綜上所述，克勒溝的晚疫病菌線粒體單倍型最多，小葦子溝采樣點晚疫病菌線粒體單倍型最少，僅存在ⅠR3，說明圍場縣晚疫病菌群體以ⅠR3為主，占80%，不同地區間晚疫病菌群體也存在著一定的遺傳差異。

2.4 SSR基因型分析

利用8對SSR引物對60株被測菌株進行PCR擴增，分析電泳圖譜，共檢測到18個等位基因。根據8個基因座上等位基因的組合，將被測菌株分為5個基因型，分別用大寫英文字母A、B、C、D、E來表示，基因型A 38株，占63.33%，且在5個采樣點均有分布，具絕對優勢；基因型D有11株，占18.33%，僅次于基因型A，主要分布在銀窩溝；基因型B、基因型C分別有8、1株，分別占13.33%、1.67%，主要分布在克勒溝與銀窩溝；基因型E有2株，占3.33%，分別來自克勒溝、銀窩溝。5個采樣點中，銀窩溝基因型最豐富，包含A、B、D、E 4種SSR基因型；其次為克勒溝與扣花營，分別包含A、B、E和A、C、D 3種SSR基因型；永和棧與小葦子溝的基因型比較單一，均為基因型A。由此可知，不同地區致病疫霉SSR基因型之間有一定差異。根據8個微衛星標記的擴增結果進行聚類分析（圖4），當相似系數為0.75時，被測菌株分為α、β 兩大分支，其中α分支包括58個菌株，包括A、B、C、D 4種SSR基因型，且均為甲霜靈高抗菌株；β分支僅有2個菌株，僅包括1種SSR基因型，為甲霜靈敏感菌株。由此可知，菌株的SSR基因型與甲霜靈抗性間存在一定的相關性，甲霜靈抗性群體數量、遺傳多樣性都明顯高于甲霜靈敏感群體。此外，圍場縣晚疫病菌群體SSR基因型與地理來源、線粒體單倍型無相關性。

3 結論與討論

從交配型、甲霜靈抗性等表型測定結果來看，近10年來圍場縣晚疫病菌群體結構幾乎未發生變化。本研究結果表明，2012年采自圍場縣的60株晚疫病菌均為A1交配型，絕大多數為甲霜靈高抗菌株，占96.67%。朱杰華等[6]、王文橋等[7]發現河北省存在A2交配型。沈江衛等研究表明，采自圍場縣的晚疫病菌全部為A1型。這意味著晚疫病菌A2交配型在2000年前后可能通過種薯調運傳播到圍場縣，之后隨著晚疫病菌群體的年度間遺傳飄變而消失，可能是由于A2交配型病菌不適合圍場縣的氣候類型[19]。李煒等研究表明，采自圍場縣的49株晚疫病菌中，40.8%表現高度抗性，49%表現中度抗性[20]。陳良華等對甲霜靈抗性的檢測結果表明，高抗菌株分別占被測菌株的88.5%與72.3%[21]。這說明河北圍場晚疫病菌群體從20世紀90年代已對甲霜靈產生了普遍的抗藥性，且抗性程度高，但生產中仍有不少農戶還采用含有甲霜靈成分的藥劑來防控馬鈴薯晚疫病，因此應加強對當地農民的教育，讓他們不再使用該類藥劑防控晚疫病，以免浪費人力物力，給當地環境造成惡劣影響。

以PCR為基礎的線粒體單倍型檢測方法更有利于揭示晚疫病群體的多樣性，發現其動態變化。2008年，Guo等報道，中國北方地區馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型單一，僅存在Ⅱa 1種[22]。本研究采用以PCR為基礎的mtDNA單倍型檢測方法，在圍場縣共發現了ⅠR3、ⅡR2、ⅡR3 3種單倍型，其中ⅠR3占80.00%，其次為ⅡR2，占18.33%，此外還發現了1株ⅡR2單倍型。筆者所在實驗室對圍場縣致病疫霉mtDNA單倍型近幾年監測結果表明，2004年僅檢測到ⅠR3單倍型；2006年檢測到ⅠR3、ⅡR2 2種單倍型，90%的菌株為ⅠR3，10%的菌株為ⅡR2；2007年檢測到ⅠR3、ⅡR2、ⅡR3 3種單倍型，58.82%為ⅠR3，35.29%為ⅡR2，剩余1.67%為ⅡR3；2011年檢測到ⅠR3、ⅡR32種單倍型，82.35% 為ⅠR3，17.65%為ⅡR3，這表明圍場縣馬鈴薯晚疫病菌群體年度間不斷發生變化。

本研究結果表明，SSR基因型與晚疫病菌對甲霜靈抗性有一定相關性，這與吳婧蓮等的研究結果[23]一致。2002年，Knapova 等利用AFLP、SSR 2種分子標記對采自瑞士及法國的馬鈴薯、番茄的致病疫霉群體結構進行了分析，結果表明，AFLP、SSR分子標記所檢測遺傳多樣性與致病疫霉地理來源、生理小種、交配型、甲霜靈抗性等表型之間并無相關性[24]。姚國勝等對河北省、黑龍江省致病疫霉群體結構進行了分析，結果表明，SSR分子標記與甲霜靈抗性、交配型也沒有相關性[13]。Mahuku等認為，可能是交配型、生理小種和對甲霜靈抗性等表型變異僅與1個或幾個基因變異程度有關[25]。本研究結果表明，SSR基因型與甲霜靈抗性具有相關性，筆者認為，這主要是由于敏感菌株在群體中的比例極小，因此它形成了1個單獨的SSR基因型。圍場縣馬鈴薯晚疫病菌群體結構一直在改變，由于線粒體單倍型和SSR基因型較交配型和甲霜靈抗性等表型性狀相比具有更高的多樣性，因此在晚疫病菌群體結構和動態演化中具有更重要的作用。

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