NaCl脅迫處理對豇豆幼苗抗氧化酶活性的影響

代其林　王金玲　馬明莉　呂旭才　郭翠　王勁　杜世章

摘要：主要研究150 mmol/L NaCl脅迫處理對豇豆（Vigna unguiculata Linn.）幼苗葉片抗氧化酶活性的影響。結果表明，豇豆幼苗在受到NaCl脅迫后，其葉片內可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量隨脅迫時間的延長均逐漸升高，脅迫12 h后，它們的含量都達到峰值；在150 mmol/L NaCl脅迫過程中，豇豆幼苗葉片的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等活性在0～12 h期間逐漸上升，12 h后其活性也均達到最高值；在12～48 h脅迫期間，3種抗氧化酶活性逐漸下降，但仍強于非鹽脅迫下的抗氧化酶活性。同時，對NaCl脅迫下這3種抗氧化酶基因的相對表達水平進行熒光定量分析，結果表明，SOD和CAT 等2種抗氧化酶基因相對轉錄表達水平與脅迫期間內相應酶的活性變化一致，而POD基因表達在脅迫6 h后就已經達到最大值，與其酶活性在12 h后達最大值是不一致的。分析結果表明，在鹽脅迫下NaCl誘導了SOD、POD、CAT等 3種酶基因的表達，抗氧化酶活性相應增強，從而增強了豇豆幼苗應對NaCl脅迫的能力，為鹽堿地培育豇豆作物具有一定指導意義。

關鍵詞：NaCl脅迫；豇豆幼苗；抗氧化酶；可溶性蛋白；脯氨酸；丙二醛；實時定量PCR

中圖分類號： S643.401 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0193-04

土壤鹽漬化是一個世界性的資源問題和生態問題，是影響農業生產的主要環境因素。鹽漬土壤能通過水分脅迫、鹽分離子的生理毒害等作用對作物產生危害，因此能限制作物的生長、發育，甚至造成農作物的減產或絕收。當前，全球鹽堿地面積已達9.5億 hm2，中國有1億 hm2[1]。中國的鹽漬化土地主要分布在西北和華北地區，并有逐年擴大的趨勢，而這些地區是我國主要的產糧地區，植物耐鹽研究已經成為當今研究的熱點。

在正常狀態下，植物的光合作用和呼吸作用等代謝途徑都會產生電子，電子在質膜上進行傳遞時會不斷產生活性氧，這些活性氧包括超氧自由基（ O-2 · ）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）[2-7]。NaCl等鹽非生物脅迫過程中所產生的低濃度活性氧可作為信號分子在植物的氧化還原反應中進行信號轉導[8]，引起一系列的生理生化反應，并產生一定的生理抗性。而中度和重度非生物脅迫都會使植物體內產生過多的活性氧，使植物體內產生氧化脅迫[9-12]，甚至會嚴重破壞細胞的穩定性和正常的代謝，通常使脂質、蛋白質和核酸受到氧化損傷，從而造成細胞損傷，最終導致細胞死亡[5，13-15]。同時，NaCl等鹽脅迫還會啟動膜脂過氧化或膜脂脫脂作用，從而破壞膜結構，使質膜流動性增大，電解質滲出率增加，細胞內代謝毒物 （如丙二醛、MDA等）積累增多[8，16-18]。因此，活性氧參與了植物光合作用的調節、脅迫應答、病原反應、程序性細胞死亡、激素調節以及植物的生長發育等生理生化反應[5，19]。植物為了應對活性氧所引起的氧化脅迫，在進化過程中產生了一個有效的抗氧化防御系統[20]，這個防御系統主要由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等組成，其中SOD能清除超氧離子，POD能清除過氧化物，二者產生的過氧化氫由CAT轉化成氧氣和水，從而解除活性氧對植物的毒害作用[15，19，21]。因此，抗氧化酶系統是植物應對氧化脅迫的一個重要反應機制[11，21- 22]。

豇豆（Vigna unguiculata Linn.）屬于豆科豇豆屬，是中國重要的蔬菜作物，在整個生長發育期對鹽脅迫都很敏感。筆者發現，在0～250 mmol/L NaCl脅迫12 h后，豇豆幼苗葉片的可溶性蛋白質、脯氨酸、丙二醛含量以及抗氧化酶活性逐漸升高，在150 mmol/L時達到最大值[18]。本研究選取豇豆作為研究對象，考察150 mmol/L NaCl脅迫處理下豇豆幼苗葉片抗氧化酶活性的變化，測定丙二醛（MDA）、脯氨酸含量的變化，初步探索豇豆幼苗葉片3種抗氧化酶基因在NaCl脅迫下基因表達水平的變化，以期為今后豇豆在鹽堿地栽培生產提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

豇豆品種為翠寶198豇豆。該品種抗病性強，特耐高溫，具有分枝多、肉質脆嫩、爽甜、纖維少、不易老化等特點。

1.2 種子預處理

將豇豆種子用1% NaClO溶液浸泡10 min，流水沖洗3～5次后吸脹12 h，于25 ℃的光照培養箱中萌發24 h，再用蒸餾水清洗萌發的種子2～3次。將萌發一致的種子播種在已滅菌石英砂中，澆上MS營養液，置于人工培養室（25±1） ℃培養，每天補充水2次。待所有幼苗的第1對真葉全部展開時，選取長勢一致的幼苗，分成2組：（1）對照組，（2）NaCl等鹽脅迫試驗組，每組重復3次。其中對照組直接用MS培養液澆灌，鹽脅迫試驗組都用含150 mmol/L NaCl的MS培養液對其進行鹽脅迫處理。然后分別在處理后0、6、12、24、48 h后取樣。每次取樣均取豇豆的第1對真葉為試驗材料，每次試驗重復3次，取其平均值。

1.3 葉片酶粗液的提取

稱取約0.5 g豇豆葉片組織于預冷的研缽中，加少量石英砂，2 mL （0.1 mol/L pH值6.8）的Tris-HCl緩沖液，在冰浴中研磨成勻漿，用2 mL緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液也轉至離心管中，在4 ℃下，4 000 r/min離心20 min。將離心管的上清液分裝于多個1.5 mL離心管中，儲存于-80 ℃冰箱中。

1.4 分析與測定

可溶性蛋白質含量的測定按照Lowry法[23]，用牛血清蛋白溶液制作標準曲線；丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[24]；脯氨酸含量用茚三酮法[24]測定；用NBT光還原法測定超氧化物歧化酶的活性[25]；按Omran的方法測定過氧化物酶的活性[26]。而過氧化氫酶活性按Beers和Sizer的方法[27]進行。endprint

1.5 抗氧化酶基因的相對表達

用無DNA的RNA試劑盒（上海華瞬生物技術有限公司，W6711）提取豇豆幼苗葉片總RNA，然后把總RNA反轉錄合成第1鏈cDNA （reverse-transcription Kit，TaKaRa，Japan）。用IQ5 Real-time PCR儀（Bio-Rad）和根據Two-step QuantiTect SYBR Green PCR Kit試驗指南對POD、SOD、CAT基因進行定量擴增，用iCycler定量分析軟件（iCycler real-time detection system software，version 2.0）對基因的定量擴增數據。用Primer 12 Express 2.0 （Applied Biosystems）軟件設計定量擴增引物（SOD、POD和CAT基因的引物分別為：POD F（5′-GGCATGTATTATGTTTCGTGCGTCTC-3′）和R（5′-GCGTCACAACCATTGACAAAGCAG-3′）；SOD F（5′-GTTCAACGGCGGAGGTCA-3′）和R（5′-AACATCAATACCCACCAGAGGA-3′）；CAT F（5′-GAAGGTTTCGGCGTCCACA-3′）和R（5′-TTGGTCACATCAAGCGGGTC-3′）；以及內參基因β-actin F（5′-ACTGTGCCAATCTACGAGGGTT-3′）和R（5′-TCTTACAATTTCCCGCTCTGCT-3′），其qRT-PCR產物長度為100～300 bp。用豇豆的β-actin管家基因來作為定量擴增的內參。所有的實時定量PCR擴增都重復3次。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫條件下豇豆幼苗葉片中總可溶性蛋白含量的變化

在NaCl等鹽非生物脅迫條件下，可溶性蛋白參與了植物細胞滲透勢的調節，較高質量分數的可溶性蛋白質，有利于植物細胞維持較低的滲透勢，減少細胞內水分和溶質的流失[28]，從而減少鹽脅迫帶來的損壞。在150 mmol/L NaCl脅迫下，隨著鹽脅迫時間的延長，可溶性蛋白含量逐漸增加（圖1），在脅迫12 h后，可溶性蛋白含量最高，為 819.812 μg/g，隨后又逐漸下降。而對照組在0～48 h內可溶性蛋白質含量變化不大。

2.2 NaCl脅迫條件下豇豆幼苗葉片中丙二醛含量的變化

在逆境條件下，往往會發生膜脂過氧化作用，丙二醛是其產物之一，通常利用它來作為脂質過氧化的指標，表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱[29]）。豇豆幼苗在經150 mmol/L NaCl脅迫后，豇豆葉片的丙二醛含量一直升高。在脅迫12 h后，豇豆幼苗葉片丙二醛含量達最高，然后逐漸下降（圖2）。表明在NaCl脅迫下，豇豆幼苗葉片通過提高丙二醛含量來抵御外界脅迫對膜脂流動和穩定性的影響。

2.3 NaCl脅迫條件下豇豆葉片中脯氨酸含量的變化

植物中游離脯氨酸具有較強的滲透調節能力及保護細胞膜結構穩定的作用，有助于維持低滲透壓提高植物對水分的吸收[30]。在150 mmol/L NaCl脅迫下，豇豆幼苗葉片的脯氨酸含量逐漸上升，在脅迫12 h時達到最大值，然后逐漸下降（圖3）。表明豇豆幼苗受到NaCl脅迫時，能夠通過增加脯氨酸含量來提高細胞滲透勢，從而提高豇豆抗性。

2.4 NaCl脅迫條件下豇豆葉片抗氧化酶活性的變化

在植物體內的抗氧化防御體系中，POD、SOD、CAT等酶系是最重要的保護酶類。在NaCl脅迫下，清除活性氧的抗氧化酶活性發生明顯的變化，豇豆葉片中POD、SOD和CAT等酶系活性都不斷增強（圖4），在脅迫12 h后，活性均達到最大值，分別為61.475、28.965、125.863 U/（mg·min），然后又

逐漸減弱。說明在NaCl等鹽脅迫過程中，植物體通過增強其抗氧化酶的活性來清除活性氧，避免逆境脅迫對自身的不利影響。

2.5 NaCl脅迫條件下豇豆葉片中抗氧化酶基因相對表達的變化

為了研究植物鹽脅迫下的耐鹽機制，用實時熒光定量PCR的方法研究3個抗氧化物酶基因在NaCl脅迫下的表達（圖5）。在150 mmol/L NaCl 脅迫后，豇豆幼苗葉片POD、SOD、CAT基因的表達水平存在差異。其中，沒有用鹽處理的3種抗氧化酶基因有少量表達；在NaCl 脅迫后，豇豆幼苗葉片的POD、SOD、CAT等抗氧化酶基因的相對表達水平都有不同程度的增強，3個基因的表達水平都增加，其中SOD、CAT基因在 NaCl脅迫12 h后達到最大水平，與其酶活性的變化趨勢一致，而POD基因在NaCl脅迫6 h后就達到最大表達水平，然后三者的表達量都開始下降。

3 結論與討論

植物遭受NaCl等鹽脅迫時，其體內的生理生化特性發生巨大變化。植物光合作用和呼吸作用所產生的過多電子在傳遞過程中，產生大量的活性氧[31-32]，過量活性氧對植物產生嚴重的氧化傷害，為了減輕或免于受到氧化傷害，植物啟動了自身的防御系統，活性氧清除酶系統和非酶系統，其中SOD、POD、CAT是清除活性氧酶系統中最重要的種酶類。它們可以相互作用，降解活性氧種類，其中超氧化自由基被SOD催化發生歧化反應生成O2和H2O2，產生的H2O2再由POD、CAT分解[29]，從而減輕NaCl等非生物脅迫。本研究結果表明，在NaCl等鹽脅迫下，豇豆幼苗葉片中3種抗氧化酶的活性與植物抗氧化脅迫能力相關，它們活性高低可作為衡量植物抗逆性強弱的重要指標。豇豆幼苗在受到NaCl脅迫時，其SOD、POD、CAT活性都增強，隨著鹽脅迫時間的延長，抗氧化酶均逐漸增加，三者酶活性12 h后最高，分別達到28.965、61.475、125.863 U/（mg·min）。盡管鹽脅迫使SOD、POD、CAT活性都有所增強，但鹽脅迫使細胞質膜處于氧化狀態而受到損害，所以隨著鹽脅迫的進行，脯氨酸和MDA含量增加，質膜受損傷程度也逐漸加重。鹽脅迫下豇豆幼苗葉片抗氧化物酶基因的表達都發生了變化，在沒有NaCl處理時豇豆葉片POD、SOD、CAT基因都有微量表達，在150 mmol/L NaCl脅迫后，3種抗氧化酶基因表達都增加。POD基因表達量在脅迫6 h后就達到最高，而CAT和SOD的基因表達量在脅迫12 h后都達到最高，然后三者的基因表達均下降，與相應酶的活性變化基本一致，這與甘藍型油菜在鹽脅迫下基因表達與酶活性的變化情況[17]一致。表明這3個抗氧化酶基因都是誘導型表達的基因，在鹽等逆境脅迫下，它們均可以過量表達。endprint

非酶活性氧清除系統也會發生巨大的作用，脯氨酸與可溶性蛋白是植物體內普遍存在的物質，在逆境條件下，二者通過參與體內的某種代謝活動對植物進行保護性的調節，以增強抗逆性[31]。在NaCl等鹽脅迫下，脯氨酸的積累是植物體抵御滲透脅迫的有效方式之一。脯氨酸含量的增加能夠降低葉片細胞的滲透勢，防止細胞脫水；而且脯氨酸具有很高的水溶性，可以保護細胞膜系統，維持細胞內酶的結構，減少細胞內蛋白質的降解。大量研究表明，許多植物在鹽脅迫下脯氨酸迅速積累，耐鹽植物中的脯氨酸含量高于不耐鹽植物[29，31]。MDA是膜脂過氧化作用的最終產物，其含量的高低是膜脂過氧化程度的重要標志[31]。

本研究結果顯示，鹽脅迫可誘導豇豆葉片中抗氧化酶活性的增強，這些酶有可能協同作用共同抵抗鹽脅迫造成的氧化傷害，但這種誘導作用并非是無限的，重度脅迫可能對植物造成不可逆的傷害。由此推測，嚴重鹽脅迫對豇豆造成了一種不可逆的傷害，但相關機制還有待于進一步研究證實。

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