天山北坡奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定

康立超　盧春霞　劉長彬

摘要：對分布于天山北坡的4個集約化奶牛場進行了乳房炎發病情況和病原學研究。結果顯示，通過對300頭產奶牛和1 162份奶樣的檢測，發現臨床乳房炎頭數陽性率為11.2%，乳區陽性率為8.0%，主要病原菌有無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和少動鞘氨醇單胞菌，均有較高的耐藥性。隱性乳房炎頭數陽性率為73.24%，乳區陽性率為42.91%，病原菌較雜（少動鞘氨醇單胞菌、溶血葡萄球菌、陰道加特納菌、西宮皮球菌、坐皮膚球菌、口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、產硫球鏈菌、玫瑰色庫克菌、奈瑟菌），對常見抗生素有敏感性。由以上結果可見，天山北坡集約化牛場臨床型乳房炎和隱性乳房炎的發病率較高，且臨床型乳房炎致病菌對抗生素均有較高的耐藥性。

關鍵詞：奶牛；乳房炎；病原菌；分離鑒定

中圖分類號： S858.237.2+6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0271-04

奶牛乳房炎是奶牛的一種常見多發性疾病，發生乳房炎的奶牛產奶量下降，牛奶品質降低，干擾正常繁殖機能，病情嚴重時造成奶?；疾∪閰^廢棄、失去泌乳能力而被淘汰，造成巨大的經濟損失。引起奶牛乳房炎的因素很多，可由創口、環境微生物、傳染性微生物等引起，其中傳染性病原微生物引起的乳房炎最為常見，危害最大[1]。奶牛乳房炎的病原體有80～130種，其中主要為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霉形體、乳房鏈球菌、大腸桿菌、化膿桿菌等。據調查，無癥狀的隱性乳房炎發病率更高，約占整個牛群的50%，其中約90%由鏈球菌和葡萄球菌引起[2]。本試驗針對天山北坡地區的4個奶牛場進行了乳房炎的調查和病原的分離與鑒定，以期找出導致該地區奶牛乳房炎的主要致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 來自天山北坡養牛經濟帶的4個奶牛場的300頭產奶牛乳樣。

1.1.2 培養基及試劑 綿羊鮮血瓊脂培養基，BHI培養基，普通營養瓊脂，購自杭州微生物試劑有限公司；奶牛隱性乳房炎臨床診斷（CMT）試劑，購自北京福茂大地商貿有限公司。

1.1.3 儀器 VITEK-2全自動生化鑒定儀，精密恒溫培養箱，乳品分析儀（Lactoscan 5557），體細胞計數儀（Nucleo Counter SCC-100）。

1.2 方法

1.2.1 奶樣的采集及分析 分別從4個奶牛場的擠奶廳里，隨機確定采樣奶牛。先用溫水拭凈采樣乳區皮膚，再用75%乙醇消毒，采用無菌操作擠奶，棄去頭3把奶，用無菌瓶分別收集4個乳區的乳樣，每個乳區采集約30 mL，低溫冷藏保存，4 h內送回實驗室進行乳品品質分析和體細胞計數。

1.2.2 乳房炎的檢測 在乳樣采集時，先用溫水擦洗奶牛乳房，擦洗過程中注意觀察乳房是否有不同程度的充血、腫脹、發硬、發熱，尤其觀察是否有疼痛感。若有以上癥狀，在擠奶過程中要特別注意，并記錄牛號，觀察乳汁有無變稀薄，且有無絮狀物或凝塊，以及膿汁和血液，若有以上癥狀并結合乳房變化判定為臨床乳房炎。如果眼觀無明顯變化，則在反應盤留取奶樣2 mL左右，加入等量的CMT診斷液，緩慢搖動，使奶樣與診斷液充分混合，觀察凝集現象并記錄結果，按CMT判定標準對每個檢樣進行判定是否為隱性乳房炎。

1.2.3 細菌的分離培養和染色鏡檢 將判定為臨床乳房炎的10份乳樣（L1至L10）和隱性乳房炎的10份乳樣（Y1至Y10），分別取0.1 mL均勻涂布于5%綿羊鮮血瓊脂平板上，放入37 ℃溫箱中培養24～48 h。培養后觀察培養基上有無菌落生長，觀察在不同培養基上所形成單個菌落的形態特征、溶血及生長情況等，對不同形態的菌落進行涂片、染色、鏡檢。在鮮血平板上生長的菌落形態特征、溶血及生長情況等一致，染色鏡檢結果相同的暫歸為同一種菌；在同一個平板上同一病料初次接種生長的同一種菌，菌苔和菌落數量明顯較多的歸為優勢菌株。

1.2.4 生化鑒定 分離到的不同種類的細菌，根據革蘭氏染色情況，革蘭氏陽性菌上GP生化鑒定卡，革蘭氏陰性菌上GN生化鑒定卡。按照VITEK-2說明書操作進行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 將純化優勢菌株的單菌落接種到BHI液體培養基，37 ℃搖床培養24 h，用滅菌棉簽均勻涂布于5%綿羊鮮血平板上，再分別貼上藥敏紙片37 ℃培養24 h。觀察對常用獸藥（阿奇霉素、頭孢噻肟鈉、氨芐西林鈉、慶大霉素、氧氟沙星、泰樂菌素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、鏈霉素、青霉素G）的敏感性（藥敏紙片藥品含量與判定標準參考杭州天和微生物試劑有限公司）。

2 結果與分析

2.1 調查概況

本試驗共采集300頭產奶牛的1 162份乳樣，其中有38個乳區瞎。其中，臨床乳房炎陽性的乳樣，由于奶性質變化較大，未檢測乳品品質和體細胞計數。經檢測，奶牛生鮮乳平均體細胞在78.06萬/mL，非脂乳固體為7.75 g/100 g（國家限量標準為≥8.1 g/100 g），密度1.026 g/mL 20 ℃/4 ℃（國家限量標準為≥1.027），蛋白質為2.86 g/100 g（國家限量標準為≥2.8 g/100 g），脂肪為4.28 g/100 g（國家限量標準為≥3.1 g/100 g），冰點為-0.48 ℃（國家限量標準為-0.5～-0.56 ℃），雜質度為2.5 mg/L（國家限量標準為≤4.0 mg/L），礦物質為0.73 g/100 g。

2.2 奶牛乳房炎發病率

通過對300頭產奶牛臨床診斷和乳汁變化分析，臨床乳房炎結果按乳區計算的發病率為8.0%，按牛頭數計算為11.2%。用CMT法檢測隱性乳房炎發病率，按乳區計算為42.81%，按牛頭數計算為73.24%。

2.3 細菌的分離鑒定

通過對20份乳樣的細菌培養，10份臨床乳房炎乳樣品中，培養均發現有病原菌存在，根據菌落的形態特征、溶血和染色鏡檢情況等挑選分離得到8株細菌（A1至A8）；隱性乳房炎的10份乳樣，在5%綿羊鮮血平板培養有8份發現有細菌生長，2份未發現任何細菌生長，根據菌落的形態特征、溶血和染色鏡檢情況等挑選分離得到10株細菌（B1至B10）。將分離到的18株菌，根據革蘭氏染色情況，用VITEK-2 Compact鑒定出10種不同的細菌（表1），主要有：無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、少動鞘氨醇單胞菌、溶血葡萄球菌、陰道加特納菌、西宮皮球菌/坐皮膚球菌、口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、產硫球鏈菌、玫瑰色庫克菌、奈瑟菌。少動鞘氨醇菌在臨床乳房炎和隱性乳房炎乳樣中都被分離到。臨床乳房炎乳樣中還分離到無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，其他菌均只在隱性乳房炎乳樣中分離到。通過表2細菌分布情況可以看出，臨床乳房炎中無乳鏈球菌占70%、金黃色葡萄球菌占80%和少動鞘氨醇單胞菌占50%，為主要優勢病原菌。隱性乳房炎中少動鞘氨醇單胞菌占40%，溶血葡萄球菌占30%，西宮皮球菌/坐皮膚球菌占30%，口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌占40%，玫瑰色庫克菌、產硫球鏈菌、陰道加特納菌和奈瑟菌各占10%。因此，病原菌較復雜，沒有明顯的優勢病原菌。endprint

2.5 藥敏試驗

金黃色葡萄球菌全部耐藥，無乳鏈球菌對青霉素有敏感性，少動鞘氨醇單胞菌對慶大霉素和氧氟沙星有敏感性，溶血葡萄球菌對氧氟沙星和恩諾沙星有敏感性，玫瑰色庫克菌對青霉素、阿奇霉素、克林霉素、慶大霉素、氧氟沙星、氟苯尼考和頭孢噻肟鈉等敏感，陰道加特納菌對頭孢噻肟鈉、克林霉素、氨芐西林鈉、氧氟沙星、阿奇霉素和慶大霉素等有敏感性。

3 討論

本試驗中檢測乳房炎的發病率非常高，隱性乳房炎頭數陽性率可達73.24%，乳區陽性率達42.91%，比2008年李建軍報道新疆集約化牛場隱性乳房炎頭數陽性率為64.75%、乳區陽性率為36.6%有所增加。近幾年規?；B殖都有合理、配套的管理程序和規范，以及先進配料和擠奶設備，為什么乳房炎的發病率有增無減呢？筆者采樣時發現，在本試驗采樣中近10%臨床乳房炎陽性牛，發病乳區所產的乳汁明顯不正常，但這樣的牛仍然出現在擠奶廳里，并且這樣的乳區還在正常機械化擠奶?；加腥榉垦椎呐＠^續擠奶，除擠奶工本身的問題外，還有監管的問題。因此，要加大對擠奶人員的技術培訓，提高專業素質；嚴格監管，提高責任心；嚴格按擠奶程序進行規范操作；及時檢查奶牛個體情況，及早發現隱性乳房炎給予治療；患乳房炎的奶牛嚴禁上廳擠奶，防止交叉感染。

如此高的乳房炎發病率嚴重影響奶牛生鮮乳的品質。本試驗中生鮮乳品質分析，蛋白質含量為2.87 g/100 g，雖然達到了我國最新奶業安全標準2.8 g/100 g， 但遠低于發達國家氨醇單胞菌；B9、B10：奈瑟菌

3.0 g/100 g以上的標準，與歐美國家有很大差距。非脂乳固體為7.69 g/100 g，未達到國家標準的8.1 g/100 g，密度為1.026 g/mL，也未達到國家標準的1.027 g/mL。通過比較發現，我國生鮮乳品質與歐美國家還有很大差距，因此，提高奶牛的飼喂營養水平，加強乳品質投入品的質量；改善飼養管理和環境衛生條件，嚴格控制和預防乳房炎的同時，也需要社會各界對奶牛產業的發展提供支持和幫助。

我國生鮮乳檢測標準中還未將體細胞數列入檢測指標。但國際奶牛聯合會規定，體細胞數在20萬～40萬/mL為隱型乳房炎，50萬/mL以上為臨床型乳房炎[3]。目前我國也只有三元、光明、伊利等少數幾家大型乳業公司在收購原料奶的時候要求控制體細胞數， 一般的要求是≤60萬/mL[3]。本試產硫球鏈菌；i：奈瑟菌；j：陰道加特納菌。

驗檢測平均生鮮乳體細胞在78.06萬/mL，這也進一步反映了奶牛乳房炎的嚴重性。如果按照體細胞數大于60萬/mL為乳房炎計算，頭數乳房炎陽性率可達60.56%，乳區乳房炎陽性率達25.82%。控制體細胞的關鍵是控制乳房炎的發病率。在國外乳業發達國家，體細胞數是必檢指標，并且都有強制的規定，比如歐盟、澳大利亞、新西蘭要求不超過40萬/mL，美國要求不超過75萬/mL。生鮮牛奶中平均體細胞數限量最低的國家是瑞士，約為10萬/mL[4]。因此我國的牛奶體細胞數控制歷程還很嚴峻。

本試驗對10份有明顯癥狀的臨床乳房炎的乳樣進行細菌分離，10份乳樣均檢出細菌，細菌的檢出率為100%。根據菌落形態分離到8株菌，鑒定為無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和少動鞘氨醇單胞菌3種菌。對10份經CMT檢測陽性的隱性乳房炎的乳樣進行細菌分離，8份乳樣檢出細菌，細菌的檢出率為80%。而2份未分離到細菌，可能是因為該隱性乳房炎病原可能是支原體、衣原體或病毒等較難培養的微生物引起。根據菌落形態分離到10株菌，鑒定為8種菌。臨床乳房炎為乳房炎發病后期，病原菌較單一，為常見優勢病原菌，而隱性乳房炎分離到細菌較復雜，沒有特定的優勢菌。金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌是報道的常見乳房炎病原菌。本試驗從隱性乳房炎中分離到的少動鞘氨醇單胞菌[5-6]、溶血葡萄球菌[7-8]、玫瑰色庫克菌[9-10]、奈瑟菌[11]、陰道加特納菌[12]均有致病性的報道。雖然由于細菌生化鑒定儀VITEK-2 Compact 對口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌、西宮皮球菌和坐皮膚球菌兩兩不能區分菌種，但西宮皮球菌[13]、口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌[14]也有相關的致病性報道。坐皮膚球菌和產硫球鏈菌相關文獻較少，是否有致病性，還有待進一步驗證。

藥敏試驗結果顯示，臨床乳房炎病原菌由于長期使用抗生素治療，產生很強的耐藥性，而隱性乳房炎分離菌對大多數抗生素有敏感性，在早期治療過程中有很好的借鑒作用。文獻報道中隱性乳房炎病原菌主要有金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等[15-17]。本試驗分離到隱性乳房炎細菌與報道的差異很大?？赡苁潜驹囼灤_定的隱性乳房炎更接近發病初期，因此，所分離到的細菌均為醫院報道病原菌，在發展到臨床型乳房炎時被致病性更強的如金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等所取代。本試驗在臨床乳房炎中分離到金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌，但未分離到大腸桿菌，也可能是由于本試驗樣品量較少所致。

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