水蛭素對冷凍前后豬精液中超氧化物歧化酶活性及mRNA表達的影響

楊尚雪　李珣　王曉曄　石博妹　唐胤晟　許春榮　唐榮福　胡傳活

摘要：課題組前期試驗表明，0.08%水蛭素能夠顯著提高凍后豬精液質量。為研究其作用機理，用含不同濃度（0、0.04%、0.08%、0.12%）水蛭素的稀釋液稀釋美系長白公豬精液，分別檢測平衡后及凍融后精液中超氧化物歧化酶的活性和mRNA表達量的變化。結果表明：（1）不含水蛭素的冷凍稀釋液顯著降低新鮮豬精液超氧化物歧化酶活性（P0.05）；（2）含有0.08%水蛭素的豬精液平衡及凍融后的超氧化物歧化酶mRNA表達量最高，但差異不顯著（P>0.05）。總之，添加0.08%水蛭素對冷凍前后豬精液超氧化物歧化酶活性及mRNA表達無顯著影響。

關鍵詞：豬精液；冷凍保存；水蛭素；超氧化物歧化酶；酶活性；mRNA表達量

中圖分類號： S828.3+4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0275-04

冷凍保存過程對精子質膜產生物理和化學應激，降低精子凍后質量，影響活力與受精能力[1]。這些損傷均與冷凍保存過程引起精子質膜脂質過氧化反應而產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關[2-4]。用于冷凍保存的新鮮豬精液中添加合適的冷凍稀釋液非常重要。研究表明，稀釋液中添加抗氧化劑能有效防止氧化應激傷害精子，常見的如半胱氨酸、維生素E可以延長凍后精子壽命[5-9]。水蛙素提取自水蛭的唾液腺，是由65～66個氨基酸殘基所組成的單鏈多肽，具有降血脂、抗腫瘤、抗凝血等多種藥理活性，廣泛用于臨床治療各種疾病[10]。近年來，研究發現水蛭素具有抗氧化作用，本課題的前期研究也表明，0.08%的水蛭素能顯著改善凍后豬精液質量，但其作用機理尚不明了。本試驗用添加不同濃度水蛭素的冷凍稀釋液稀釋精液后，檢測平衡及冷凍解凍后豬精液中固有抗氧化酶——超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及其mRNA表達量的變化，以期從SOD活性及分子水平闡明水蛭素對冷凍前后豬精液中SOD功能及濃度的影響，為深入探討水蛭素提高凍后豬精液質量的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 異丙醇、無水乙醇和氯仿為天津市科密歐化學試劑有限公司產品，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、蛋白酶抑制劑（PMSF）、青霉素與鏈霉素均為北京索萊寶科技有限公司產品，卵黃取自廣西南寧市富鳳農牧有限公司生產的初產雞蛋，水蛭素（活力單位為1 250 U/g）為南寧市凈雪皇生物工程有限公司產品，BCA蛋白濃度測定試劑盒和SOD檢測試劑盒均為碧云天生物技術研究所產品，RIPA裂解液、Trizol、 HiScript Q 1st Strand cDNA Synthesis Kit （qPCR）和2 × Taq Master Mix均購于南京諾唯贊生物科技有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要儀器 程序降溫儀（法國卡蘇公司）、冰箱（海爾集團）、電子恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）、移液槍（Eppendorf）、離心機（上海安亭科學儀器廠）、0.25 mL塑料細管（Minitube）、梯度PCR儀（Biometra）、水平電泳槽及電泳儀電源（北京凱元儀器有限公司）、iMARK酶標儀（Bio-rad）。

1.1.3 精液來源 新鮮精液采自3頭廣西科達畜禽改良有限責任公司健康、性欲旺盛的美系長白種公豬。采用手握法采精，收集富含精子段的精液于預溫的潔凈燒杯中，1 h內送達實驗室處理。用8層紗布過濾后，檢查相關的精液質量指標（精子活力、畸形率及密度）。精子活力>0.7、畸形率<20%的精液繼續用于后續試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組 試驗分組見表1。

1.2.2 冷凍稀釋液配制 用電子天平按配方（葡萄糖1.65%，檸檬酸2.22%，Tris 3.63%，NAC 0.03%，青霉素0.09%，鏈霉素0.15%，甘油9.00%，蛋黃30.00%）[11]準確稱取各種試劑，雙蒸水溶解定容，5 000 r/min離心15 min。

1.2.3 精液冷凍程序 用10層紗布包裹精液，放在室溫下緩慢降溫。原精與含有不同濃度（0、0.04%、0.08%、0.12%）水蛭素的稀釋液室溫下等溫稀釋，稀釋比為1 ∶ 2（先加入1份與原精等量的稀釋液，混合均勻，平衡15 min后，再加入另1份與原精等量的稀釋液）。0.5 mL塑料細管分裝，10層以上紗布包裹后將細管放入冰箱內，5 ℃下平衡4 h。取出細管，檢查平衡后精子活力合格后，放入程序降溫儀：5～-5 ℃，3 ℃/min；-5～-42 ℃，100 ℃/min；-42～-140 ℃，30 ℃/min。冷凍程序運行完成后，取出細管迅速投入液氮中。

1.2.4 冷凍精液解凍方法 從液氮中取出細管，迅速投入37 ℃水浴，快速晃動30～60 s。

1.2.5 SOD活性檢測

1.2.5.1 細胞總蛋白的提取 將各組精液從0.5 mL塑料細管中倒入2.0 mL離心管中，輕微振蕩，吸取500 μL加入1 000 μL冷的裂解液（每1 mL冷的RIPA裂解液中加入2 μL PMSF混合物，混勻后置冰上備用），混勻后，在4 ℃條件下振蕩15 min，在4 ℃、14 000 r/min條件下離心15 min。快速將上清吸入另一預冷的干凈離心管，用于后續試驗。

1.2.5.2 BCA蛋白濃度測定 按照說明書進行，步驟如下：先配制成25 mg/mL的蛋白標準溶液，取適量25 mg/mL蛋白標準液，滅菌生理鹽水稀釋至終濃度為0.5 mg/mL；其次配制BCA工作液（BCA試劑A ∶ BCA試劑B=50 ∶ 1），充分混勻；然后將標準品按0、 1、 2、 4、8、12、16、20 μL加到96孔板的標準品孔中，加滅菌生理鹽水補足到20 μL；加10 μL樣品到96孔板的樣品孔中，加滅菌生理鹽水到20 μL；最后各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20 min后，測定吸光度D595 nm，根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。endprint

1.2.5.3 SOD酶活性測定 采用WST-8法，步驟如下：首先配制適量的WST-8/酶工作液以及反應啟動工作液；然后取20 μL待測樣品到96孔板中，加入160 μL WST-8/酶工作液以及20 μL反應啟動工作液，相應的空白對照1為20 μL SOD檢測液、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反應啟動工作液，空白對照2為40 μL SOD檢測液和160 μL WST-8/酶工作液，空白對照3為20 μL待測樣品、20 μL SOD檢測液和160 μL WST-8/酶工作液；37 ℃孵育30 min；測定吸光度D450 nm。SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶耦聯反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.6 SOD mRNA表達水平的檢測

1.2.6.1 細胞總RNA的提取 將各組精液從0.5 mL塑料細管中倒入2.0 mL離心管中，加入1 mL RNA isolater，上下顛倒混勻，加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩，4 ℃靜置10 min，12 000 g 、4 ℃離心15 min，小心吸取上層水相500 μL至含有600 μL 異丙醇的離心管中，上下顛倒混勻，4 ℃靜置10 min，12 000 g 、4 ℃離心10 min，去上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌，12 000 g 、 4 ℃ 離心5 min，棄上清，將離心管倒扣在滅菌衛生紙上3 min，加入4 μL滅菌三蒸水溶解沉淀。

1.2.6.2 cDNA合成 cDNA合成反應液體系：RNase free ddH2O 3 μL，50 μmol/L Oligo dT23VN 1 μL，2 × RT Mix 10 μL，HiScriptTM Ⅱ Enzyme Mix 2 μL，總RNA 4 μL。上述體系配制均在冰上進行，完成后，50 ℃ 水浴 45 min。

1.2.6.3 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） RT-PCR反應液體系：ddH2O 6.5 μL，2 × Taq Plus Master Mix 12.5 μL，模板DNA 4 μL，10 μmol/L引物1、引物2（表2） 各1 μL。上述體系配制在冰上進行。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環X次；72 ℃延伸7 min。

SOD與GAPDH的最優退火溫度的確定是根據DNA分子的熔點（Tm）設置溫度梯度，比較相同RT-PCR反應體系和循環圈數下不同溫度的RT-PCR產物的表達水平，表達量最高的溫度為最優退火溫度，最終SOD與GAPDH的最優退火溫度為58 ℃；SOD與GAPDH的最優循環圈數的確定是通過設置不同循環圈數，比較相同RT-PCR反應體系和退火溫度下不同循環圈數的RT-PCR產物的表達水平，到達平臺期的第1個循環圈數即為最優循環數，最終SOD為38圈，GAPDH為36圈。

用Quantity One分析系統分析DNA條帶光密度，進行統計分析。

1.2.7 數據處理 采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計。數據采用“平均數±標準差”描述，釆用單因素方差分析，各種檢驗的顯著性水平均設定為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 SOD活性試驗

由圖1可知，新鮮精液在不添加冷凍稀釋液且不平衡不冷凍（第1組）的條件下，SOD活性最高（P<0.05），添加不含水蛭素的冷凍稀釋液（第2組）后，SOD活性顯著降低（P0.05），但添加0.08%水蛭素精液的SOD活性（第5組與第9組）分別在平衡組與凍融組中最高（P>0.05）。

2.2 SOD mRNA表達水平試驗

由圖2、圖3可知，新鮮精液在不添加冷凍稀釋液且不平衡不冷凍（第1組）的條件下，SOD mRNA表達量最高，添加

不含水蛭素的冷凍稀釋液（第2組）后，與第1組相比SOD mRNA表達降低，但差異不顯著（P>0.05）；僅平衡的豬精液添加0.08%的水蛭素（第5組）與不含水蛭素既平衡又冷凍（第3組）相比SOD mRNA表達高但差異不顯著（P>0.05），與新鮮精液（第1組）無顯著差異（P>0.05）；既平衡又冷凍的豬精液添加0.08%的水蛭素SOD mRNA表達比不含水蛭素既平衡又冷凍（第7組）的高（P>0.05），與新鮮精液（第1組）無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

ROS對維持正常精子的功能至關重要，如受精能力的獲得、染色質凝集的促進、質膜的重建以及胞內信號轉導的激活等[12-14]。正常情況下，精子體內的促氧化與抗氧化水平相互平衡。然而，這一平衡狀態被冷凍保存過程打破了，產生了大量富余的ROS，引起精子氧化應激造成損傷。在冷凍稀釋液中添加合適濃度的抗氧化劑對于清除多余的ROS保護精子非常重要。超氧陰離子自由基（O-2 · ）是生物體內正常代謝的產物，但其不正常的積累將使細胞膜的脂質發生過氧化作用而引起膜裂變，導致細胞損傷甚至細胞死亡[15]。SOD是消除 O-2 · 最有效、最重要的抗氧化物酶，其催化自由基 O-2 · 發生歧化作用生成O2與H2O2，然后H2O2被體內如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶清除，因而SOD是體內防止自由基損傷的第一道防線，是生物體內最重要的抗氧化酶[16]。SOD廣泛存在于動物、植物和微生物體內，在醫藥、食品、化妝品中有廣泛的應用前景[17]。從SOD水平的高低可以看出機體抗氧化系統的狀態。

水蛭素是從藥用水蛭中提取的含有65或66個氨基酸殘基的多肽鏈[18-19]。其性味咸、苦、平，有小毒，入肝經，具有破血逐淤之功效，主要用于血淤經閉及跌打損傷等[20-22]，隨著對水蛭素研究的深入，發現其具有抗凝血、抗血栓形成以及抗氧化應激等多重效用。牟忠祥等的研究結果表明，水蛭素組灌胃干預后的荷瘤鼠，其血清中SOD 水平明顯升高，提示自由基被清除后，脂質過氧化過程受到阻斷，使水蛭素組荷瘤鼠丙二醛含量下降[23]。郭應信等對大鼠隨意皮瓣淤血模型的試驗結果表明，水蛭素能提高淤血皮瓣局部SOD水平，減少丙二醛含量，減輕局部炎癥反應[24]。Ou 等研究發現水蛭素可以清除晶狀體上皮細胞內ROS，上調SOD水平[25-26]。添加0.08%水蛭素對冷凍前后豬精液SOD活性有升高作用，但影響不顯著。這與其他研究結果部分相似，都說明水蛭素有清除ROS、升高SOD活性的作用，只是本結果不顯著，這可能是因為SOD無統一的檢測標準及表示方法[17]。endprint

不含水蛭素的冷凍稀釋液顯著降低了新鮮豬精液SOD活性，對SOD mRNA表達亦有降低影響，說明不含水蛭素的冷凍稀釋液對新鮮精液有一定的抑制作用，猜測可能是由于冷凍稀釋液中含有Tris，其為弱堿，具有刺激性，能夠抑制酶活性[27]。

4 結論

本試驗研究發現，添加0.08%水蛭素對冷凍前后豬精液SOD活性及mRNA表達影響不顯著。

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