翹嘴鱖胚胎發(fā)育期間酸性和堿性磷酸酶活性的變化

鄒立軍　莊遠(yuǎn)紅　龔婧　吉璐　黃美玲

摘要：酸性磷酸酶和堿性磷酸酶作為一種磷酸單酯水解酶，在蛋白（酶）的去磷酸化過(guò)程中起著非常重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)磷酸酶是動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中物質(zhì)代謝的重要調(diào)控酶。采用磷酸苯二鈉比色法檢測(cè)翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）胚胎發(fā)育期間酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性變化。結(jié)果顯示，胚胎受精后進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)的酸性和堿性磷酸酶活性較低，分別為（0.436±0.051） U/g和（0.061±0.009） U/g，發(fā)育至囊胚期時(shí)酶活性均有微量下降；而從原腸胚時(shí)期開(kāi)始，酸性和堿性磷酸酶的活性隨胚胎發(fā)育的進(jìn)行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在出膜時(shí)期達(dá)到最高，分別為（1.076±0.063） U/g和（0.335±0.021） U/g，酶活性顯著增強(qiáng)（P<0.05）。這一結(jié)果表明，翹嘴鱖胚胎在原腸胚期合成了磷酸酶，且磷酸酶在胚胎發(fā)育期間的細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)代謝等方面可能發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：翹嘴鱖；胚胎發(fā)育；酸性磷酸酶；堿性磷酸酶

中圖分類(lèi)號(hào)： S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0287-03

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）廣泛存在于動(dòng)物各種組織，是非特異性的磷酸單酯水解酶。它們分別在酸性和堿性條件下起催化作用，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝，有眾多的催化底物和復(fù)雜的生理學(xué)功能[1]。其活性與生命活動(dòng)密切相關(guān)，在蛋白（酶）的去磷酸化、調(diào)節(jié)跨膜運(yùn)輸及生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等物質(zhì)代謝中起著重要作用[2，3]。

胚胎期是魚(yú)類(lèi)整個(gè)生活史中的一個(gè)重要時(shí)期，這個(gè)時(shí)期內(nèi)魚(yú)類(lèi)依賴(lài)其母體提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存活，出膜以后則實(shí)現(xiàn)了其形態(tài)、代謝和生理上的巨大變化，而作為物質(zhì)代謝過(guò)程中的重要調(diào)控酶，ACP和AKP在魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。迄今為止，關(guān)于水生生物發(fā)育過(guò)程中磷酸酶的活性變化及表達(dá)模式等已開(kāi)展了相關(guān)研究[4-7]，而有關(guān)翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）胚胎發(fā)育過(guò)程中磷酸酶活性變化的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用磷酸苯二鈉比色法對(duì)翹嘴鱖胚胎發(fā)育期間ACP和AKP活性變化進(jìn)行了定量研究，以期闡明這2種酶在翹嘴鱖發(fā)育早期的活性變化規(guī)律，進(jìn)一步掌握翹嘴鱖胚胎發(fā)育過(guò)程中生理生化的動(dòng)態(tài)變化，為翹嘴鱖的生物學(xué)研究積累原始數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、檸檬酸緩沖液、磷酸苯二鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、4-氨基安替吡林、鐵氰化鉀、硼酸等試劑購(gòu)于湖南匯虹生物公司。

1.2 主要設(shè)備

Nikon Eclipse E200生物顯微鏡，購(gòu)于日本尼康公司；Biophotometer 核酸蛋白測(cè)定儀和Centrifuge 5904離心機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；臺(tái)式pH計(jì)，購(gòu)于上海精科公司；島津UV2401型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，購(gòu)于日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)材料

用于繁殖的性成熟親魚(yú)健康無(wú)傷，來(lái)自湖南省益陽(yáng)市水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。人工授精后，獲取翹嘴鱖受精卵，隨機(jī)分組，每組大約500粒，置于含曝氣水的培養(yǎng)皿中。每組設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)期間水溫控制在（20±2） ℃，靜水孵化，換水1次/h以保證溶氧充足。胚胎各發(fā)育階段劃分參照劉筠的胚胎發(fā)育觀察方法[8]，即所有魚(yú)卵必須半數(shù)以上達(dá)到某個(gè)時(shí)期才能確定為到達(dá)該時(shí)期。胚胎發(fā)育過(guò)程中，及時(shí)清除未受精卵和異常胚胎。對(duì)受精卵、桑椹胚期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、視泡出現(xiàn)期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、耳石出現(xiàn)期、出膜前期、出膜期共11個(gè)發(fā)育時(shí)期分別取樣。

1.4 樣品制備

每組分別取受精卵120粒，用濾紙吸干水分，在電子天平上稱(chēng)質(zhì)量后置于干燥的離心管中，貯存于-80 ℃冰箱備用。制樣時(shí)，按質(zhì)量體積比1 ∶ 4（g/mL）加入生理鹽水，冰浴勻漿；4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清液，分裝儲(chǔ)存于冰箱-20 ℃保存待測(cè)，用于測(cè)定酶活性的樣本在4 ℃下存放不超過(guò)1 h。

1.5 勻漿粗提液蛋白定量

酶液中可溶性蛋白含量測(cè)定采用Bradford（考馬斯亮藍(lán)）方法[9]，樣本于595 nm下測(cè)定吸光度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.6 ACP和AKP活性測(cè)定

ACP和AKP活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法[10]，510 nm 下測(cè)定吸光度。ACP和AKP活性測(cè)定緩沖液pH值分別為4.9和10。酶比活力單位的定義為：37 ℃下，反應(yīng)體系中1 mg/min蛋白酶產(chǎn)生1 μg酚所需的酶量作為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)組間差異顯著性，以P

2 結(jié)果與分析

2.1 ACP活性變化

翹嘴鱖胚胎從受精卵發(fā)育至囊胚期，酶活性變化不顯著（P>0.05），其中受精卵時(shí)期的酶活性為（0.436±0.051） U/g（圖1）；原腸胚期ACP活性開(kāi)始增強(qiáng)，發(fā)育至出膜前期的時(shí)候，酶活性明顯增強(qiáng)，數(shù)值為（0.931±0.030） U/g，與前面各發(fā)育時(shí)期相比差異顯著（P0.05）；繼續(xù)發(fā)育至出膜前期后ACP活性顯著性升高（P<0.05）；到出膜期，ACP活性已是受精卵時(shí)期酶活性的2.5倍。可見(jiàn)，翹嘴鱖胚胎從原腸胚發(fā)育開(kāi)始ACP活性隨著發(fā)育的進(jìn)行而升高。

2.2 AKP活性變化

在受精卵階段AKP活性較低，僅為（0.061±0.009） U/g（圖2）；胚胎繼續(xù)發(fā)育至囊胚期，ACP維持一定活性且有微弱降低的趨勢(shì)，但酶活性變化不顯著（P>0.05），隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，AKP活性逐漸增高，原腸胚期AKP活性為（0.096±0.014） U/g，顯著高于前面各發(fā)育時(shí)期（P<0.05）；心跳期后AKP活性增加幅度更大。耳石出現(xiàn)期、出膜前期、出膜期的酶活性，與前面各發(fā)育時(shí)期相比，顯著提高（Pendprint

3 討論

3.1 翹嘴鱖胚胎發(fā)育期間ACP特性及活性變化

ACP定位于溶酶體和內(nèi)膜系統(tǒng)，在酸性條件下催化磷酸單脂水解，在代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上起重要作用，同時(shí)作為溶酶體標(biāo)志酶，參與生物大分子消化、凋亡或壞死細(xì)胞的清除，在免疫功能和維持細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖受精卵分裂開(kāi)始時(shí)ACP活性為（0.436±0.051） U/g，發(fā)育至囊胚期時(shí)為（0.425±0.021） U/g，呈現(xiàn)微量下降的現(xiàn)象，但活性變化不顯著（P>0.05），表明了受精卵在發(fā)育早期具有一定的ACP活性，但為受精卵中的母源性酶類(lèi)，并非合子基因表達(dá)的產(chǎn)物；且胚胎早期細(xì)胞分裂對(duì)磷酸酶的需求無(wú)顯著變化。賈玉東等研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆（Scophthalmus maximus）繁殖期卵子中含有一定活性的ACP和AKP[14]，說(shuō)明這2種酶來(lái)自母體，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用。因此，受精卵中儲(chǔ)存的相關(guān)酶或mRNA對(duì)胚胎發(fā)育的啟動(dòng)具有重要作用，進(jìn)而為胚胎早期發(fā)育中細(xì)胞的快速增長(zhǎng)及遷移提供保障[15]。而翹嘴鱖胚胎發(fā)育到原腸期開(kāi)始ACP活性為（0.502±0.031） U/g，與之前相比活性有了較大的提高，說(shuō)明在原腸期合成了ACP，胚胎內(nèi)酶基因表達(dá)開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，合成水解酶，為胚胎的繼續(xù)發(fā)育提供了保證。朱俊華等研究甌江彩鯉（Diplodus sargus）早期發(fā)育過(guò)程中的ACP活性時(shí)，也發(fā)現(xiàn)出膜期的酶活性顯著增加[16]。王書(shū)平等研究金魚(yú)胚胎發(fā)育中ACP的變化也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)[7]。在本研究過(guò)程中翹嘴鱖胚胎在出膜前期已有少量的胚胎孵出，而在出膜期幾乎所有胚胎均已孵出，這2個(gè)時(shí)期ACP活性分別為（0.931±0.030）U/g和（1.076±0.063）U/g，且酶活性顯著增強(qiáng)（P<0.05）。推測(cè)出膜以后的仔魚(yú)可能由于失去了卵膜的保護(hù)而直接與外界環(huán)境接觸，需要較高的ACP活性參與生理代謝調(diào)控和免疫防護(hù)有關(guān)，因此誘導(dǎo)了酸性酶活性大幅增加。

3.2 翹嘴鱖胚胎發(fā)育期間AKP特性及活性變化

AKP是一類(lèi)膜結(jié)合蛋白，在堿性條件下催化磷酸基團(tuán)的移除，通過(guò)跨膜運(yùn)輸參與核酸、蛋白質(zhì)與脂類(lèi)物質(zhì)代謝，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化，在動(dòng)物的早期發(fā)育時(shí)期發(fā)揮重要作用[17-18]。本研究中，翹嘴鱖受精卵時(shí)期的AKP活性為（0.061±0.009） U/g，且活力處于一個(gè)較低的水平，隨著胚胎的發(fā)育，母源性mRNA的消耗，AKP在桑椹胚期與囊胚期酶的活性呈下降趨勢(shì)，但活性變化不顯著（P>0.05）。而發(fā)育至原腸胚期的酶活性為（0.096±0.014）U/g，較前面的發(fā)育時(shí)期有了顯著增強(qiáng)（P<0.05）；達(dá)到出膜期時(shí)，AKP活性達(dá)到最高，且酶活性顯著增加（P

魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中ACP和AKP的作用較為復(fù)雜，其活性變化也受外源性激素、重金屬元素和溫度等多種因素影響，不同種間也存在一定的差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，翹嘴鱖胚胎從受精卵開(kāi)始發(fā)育至囊胚期磷酸酶降至較低水平后，于原腸胚期有了較大的提高，說(shuō)明在原腸胚期合成了磷酸酶，胚胎內(nèi)酶基因開(kāi)始表達(dá)并合成水解酶，隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，磷酸酶活性顯著增強(qiáng)，這標(biāo)志著翹嘴鱖由胚胎期向仔魚(yú)期的轉(zhuǎn)變及生理機(jī)能的完善。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)受精卵時(shí)期的母源性ACP的活性要顯著高于AKP，因此推測(cè)ACP很可能參與了調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟。這些工作為進(jìn)一步確定磷酸酶在魚(yú)類(lèi)受精過(guò)程和胚胎發(fā)育中的功能提供了新的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Beck I M，van den Berghe W，Vermeulen L，et al. Crosstalk in inflammation：the interplay of glucocorticoid receptor-based mechanisms and kinases and phosphatases[J]. Endocrine Reviews，2009，30（7）：830-882.

[2]Bruce D L，Sapkota G P. Phosphatases in SMAD regulation[J]. FEBS Letters，2012，586（14）：1897-1905.

[3]Barr F A，Elliott P R，Gruneberg U. Protein phosphatases and the regulation of mitosis[J]. Journal of Cell Science，2011，124（Pt 14）：2323-2334.

[4]Kumano G N H，Zygotic Expression of the endoderm-specific alkaline phosphatase gene in embryos of the ascidian：Halocynthia roretzi[J]. Developmental Biology，1998，198（2）：245-252.

[5]孫虎山，王宜艷，梁建光，等. 貽貝（Mytilus edulis）發(fā)育早期酸性和堿性磷酸酶活性[J]. 海洋與湖沼，2008，39（1）：42-48.

[6]陳曉武，施志儀，顧一峰.牙鲆發(fā)育中ALP基因表達(dá)圖式及功能分析[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，37（6）：894-898.

[7]王書(shū)平，孔祥會(huì)，江紅霞，等. 金魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中磷酸酶活性的變化[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2011，30（7）：405-408.

[8]劉 筠.中國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)繁殖生理學(xué)[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：81-93.

[9]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（72）：248-254.endprint

[10]王繼貴，鄧寶愛(ài)，周衍權(quán)，等. 臨床生化檢驗(yàn)[M]. 長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1996：391-400.

[11]劉志鴻，牟海津，王清印.軟體動(dòng)物免疫相關(guān)酶研究進(jìn)展[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2003，24（3）：86-90.

[12]Pipe R K. Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the marine mussel Mytilus edulis[J]. The Histochemical Journal，1990，22（11）：595-603.

[13]Kong X，Wang S，Jiang H，et al. Responses of acid/alkaline phosphatase，lysozyme，and catalase activities and lipid peroxidation to mercury exposure during the embryonic development of goldfish Carassius auratus[J]. Aquatic Toxicology，2012，120/121：119-125.

[14]賈玉東，孟 振，劉新富，等. 大菱鲆（Scophthalmus maximus）繁殖期卵子和卵巢液中磷酸酶活性變化及其與受精率相關(guān)性[J]. 海洋與湖沼，2013，44（6）：1530-1535.

[15]Briggs R，Cassens G. Accumulation in the oocyte nucleus of a gene product essential for embryonic development beyond gastrulation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1966，55（5）：1103-1109.

[16]朱俊華，姚俊杰，馮亞楠，等. 甌江彩鯉早期發(fā)育過(guò)程中磷酸酶活性及間甲酚對(duì)其活性的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（2）：92-96.

[17]Ali A T，Penny C B，Paiker J E，et al. Alkaline phosphatase is involved in the control of adipogenesis in the murine preadipocyte cell line，3T3-L1[J]. Chimica Acta，2005，354（1/2）：101-109.

[18]Low M G，Saltiel A R. Structural and functional roles of glycosyl-phosphatidylinositol in membranes[J]. Science，1988，239（4837）：268-275.

[19]Shi Z Y，Chen X W，Gu Y F. Cloning and expression pattern of alkaline phosphatase during the development of Paralichthys olivaceus[J]. Fish Physiology and Biochemistry，2011，37（3）：411-424.

[20]陳慕雁，張秀梅，連建華. 大菱鲆仔稚魚(yú)期消化酶及堿性磷酸酶活性的變化[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，35（3）：483-486.采克俊，周志金，曹 訪，等. 長(zhǎng)吻精子超低溫冷凍保存[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：290-291.endprint