長吻精子超低溫冷凍保存

采克俊　周志金　曹訪　朱俊杰　李景芬　葉金云

摘要：以精子活力為研究指標，比較二甲亞砜、甘油、甲醇、乙二醇、丙二醇、乙二醇甲醚6種不同抗凍劑、平衡時間、熏蒸高度對長吻（Leiocassis longirostris）精子超低溫冷凍保存的影響。防凍液組合為：10%乙二醇甲醚/HBSS條件下平衡30 min，熏蒸高度為11 cm時，長吻的凍精活力最高。

關鍵詞：長吻；精子；超低溫冷凍保存；活力；平衡時間；熏蒸高度；乙二醇甲醚

中圖分類號： S961.2+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0290-02

魚類種質資源是進行優良苗種培育、遺傳改良和水產養殖業可持續發展的重要物種基礎[1]，而由于環境惡化以及人類的過度捕撈等原因，導致魚類種質資源匱乏。目前，超低溫冷凍保存是保存物種的有效方式[2]。由于魚卵和胚胎體積大、卵膜通透性差、卵黃含量高、含水量多、冷凍保存不易，相比之下，魚類精子的超低溫冷凍保存更易成功[1-3]。長吻（Leiocassis longirostris）作為一種新近開發的淡水經濟魚類，具有重要的經濟價值[4]，其精子冷凍保存未見文獻報道，因此筆者進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚均來自當地育苗場，選取健康狀況良好、體表無傷、無病且性成熟的魚類作為試驗魚。

1.2 試驗藥品與試劑

6種抗凍劑二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、甘油（glycerol，Gly）、乙二醇（ethylene glycol，EG）、丙二醇（propylene glycol，PG）、乙二醇甲醚（methoxyethanol，MG）、甲醇（methanol，MeOH）購于Amresco公司，其他藥品均為國產分析純。

1.3 稀釋液的配制

HBSS（漢克平衡鹽溶液）的配制：用電子天平稱取7.896 g NaCl、0.396 g KCl、0.195 g MgSO4·7H2O、0.072 g Na2HPO4·12H2O、0.054 g KH2PO4、0.345 g NaHCO3、0.99 g 葡萄糖，溶于1 000 mL純水中[5]。

1.4 方法

1.4.1 精液采集 選取性成熟的雄性親魚，剖腹取精巢，將精巢剪碎，添加試驗所用的稀釋液稀釋，用干燥的過濾漏斗將所需的精液過濾，放在Eppendorf 管中并立即置于4 ℃冰箱內，防止精子活力下降。

1.4.2 精子質量活力的檢測 精液外觀質量檢查：乳白色，無血污和糞便污染。在載玻片上滴10 μL純水，取5 μL鮮精于純水中，立即用顯微鏡觀察其活力，快速運動的精子記錄為活精子：精子活力=運動精子數/全部的精子數×100%。鮮精活力在85%以上的精液才用于試驗。

1.4.3 精子冷凍保存篩選

1.4.3.1 不同抗凍劑及其濃度對精子冷凍保存的影響 選取6種抗凍劑，添加濃度為5%、10%，稀釋液為HBSS，精液與防凍液稀釋比為1 ∶ 2，混合液分裝至麥管中，每支麥管裝100 μL，在4 ℃冰箱內平衡30 min，平衡結束后在液氮上方7 cm 處熏蒸10 min，熏蒸結束后倒入液氮中保存；解凍時在37 ℃水浴中解凍6 s，用100單位滲透壓HBSS激活后，在顯微鏡下檢測凍精活力。篩選結果顯示，10% DMSO和10%乙二醇甲醚的冷凍保存效果較佳。

1.4.3.2 不同平衡時間對精子冷凍保存的影響 4 ℃平衡時間設定為5、15、30、45、60、75 min，選取的防凍液為10% DMSO/HBSS和10% 乙二醇甲醚/HBSS。

1.4.3.3 液氮熏蒸高度對精子冷凍保存的影響 稀釋液選用HBSS，抗凍劑選用10% HBSS和10% 乙二醇甲醚。熏蒸高度分別為3、5、7、9、11 cm；熏蒸結束后倒入液氮中保存，保存5 min后在37 ℃水浴中解凍6 s；用100單位滲透壓的 HBSS 激活，在顯微鏡下檢測凍精活力。

1.4.3.4 數據處理 數據用“平均值±標準差”表示；數據分析使用SPSS 16.0進行單因素方差分析（one-way，ANOVA），P

2 結果與分析

2.1 不同防凍劑及其濃度對長吻精子冷凍保存的影響

不同防凍劑及其濃度對長吻精子冷凍保存的影響如圖1所示。在熏蒸高度為7 cm、平衡時間為30 min的條件下，當滲透性防凍劑濃度為5%時，乙二醇甲醚對長吻精子的冷凍保存作用最佳，長吻凍精活力達35.00%±4.47%；當滲透性防凍劑濃度為10%時，作用效果最好的是DMSO，精子活力達（45.00±4.47）%。所以，篩選出來的最佳防凍液為

10%DMSO+HBSS和10%乙二醇甲醚+HBSS。

2.2 不同防凍劑和熏蒸高度對長吻精子冷凍保存的影響

不同防凍劑和熏蒸高度對長吻精子冷凍保存的影響如圖2所示。在防凍液組合為10%DMSO+HBSS、熏蒸高度為7 cm時，長吻的凍精活力最高，為（49.00±3.19）%；在防凍液組合為10%乙二醇甲醚+HBSS、熏蒸高度為11 cm時，長吻的凍精活力最高，為（52.00±4.32）%。

2.3 不同防凍劑和平衡時間對長吻精子冷凍保存的影響

不同防凍劑和平衡時間對長吻精子冷凍保存的影響如圖3所示。在防凍液組合為10%DMSO+HBSS、熏蒸高度為7 cm、平衡時間為30 min時，長吻的凍精活力最高，為（40.00±3.16）%；在防凍劑組合為10%乙二醇甲醚+HBSS、熏蒸高度為11 cm、平衡時間30 min時，長吻的凍精活力最高，為（43.00±5.16）%。

3 結論與討論endprint

長吻是一種名貴的淡水經濟魚[6]，主要分布于長江流域，而隨著人類的需求日益增加和過度捕撈，導致其資源量迅速銳減[6]。目前規?；绶N生產單位多采用解剖精巢取精的方式進行人工授精，但繁殖效率依然不高，開展精子超低溫冷凍保存研究不僅可以極大地促進長吻工授精研究，而且對于魚類資源保護和遺傳改良具有重要意義。

超低溫冷凍保存，能夠使精子的運動完全停止，保證生命以靜止的狀態保存下來[3，7-8]，從而達到長期保存的目的。在冷凍之前，魚類精子必須先保存于防凍液中，因此篩選防凍液是魚類精子冷凍保存中的一個重要步驟，也是研究最多的一個領域。防凍液由稀釋液和抗凍劑組成，報道的魚類精子冷凍的稀釋液已經多達幾十種[8]，本研究以HBSS為稀釋液，HBSS滲透壓為300 mOsm/kg，屬于等滲[5]。在相關長吻精子的人工授精報道中，精子保存液滲透壓接近380 mOsm/kg[9]，與本試驗采用的300 mOsm/kg的HBSS相差較大。因此，還需要進一步研究稀釋液的滲透壓對長吻精液冷凍保存的影響。

加入適當的抗凍劑，可以提高精子滲透壓，降低冰點，有效減少精子冷凍保存過程中帶來的冰晶損傷。由于抗凍劑本身對細胞有毒害作用，而不同種類的魚類精子的生理特性具有很大差異。因此，確定最適的抗凍劑種類和濃度非常重要[3，7-8]。DMSO因其高滲透性和易與精子膜上磷脂層發生相互作用而被廣泛應用于多種魚類精子冷凍[8]，通常當其濃度達到10%時對魚類精子的冷凍保存效果最佳，此外本研究還發現乙二醇甲醚的效果較好。

滲透性抗凍劑滲入精子需要一段時間，因此在冷凍之前，將精液置于4 ℃下平衡一段時間對魚類精子冷凍非常。低溫有利于減小抗凍劑對精子的毒性，也有利于精子對冷凍環境的適應。一般魚類精子的平衡時間多控制在10～60 min之間[2，8]。對于長吻精子冷凍，最佳平衡時間都為30 min。

慢速降溫法有利于魚類精子對低溫的適應，能在凍結前充分脫水，減少冰晶形成，安全越過-15～-60 ℃這段危險溫度區；但是如果降溫速率太慢，精子就會長時間處于高滲溶液中，導致細胞收縮，出現溶質損傷，因此應篩選適宜的熏蒸高度對精子進行冷凍保存。結果表明，當熏蒸高度為11 cm且防凍液為10%乙二醇甲醚時，精子冷凍保存效果最佳。

參考文獻：

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[2]陳松林. 魚類精子和胚胎冷凍保存理論與技術[M]. 北京：中國農業出版社，2007.

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[8]采克俊，曹 訪，葉金云. 魚類精子低溫冷凍保存研究進展[J]. 湖州師范學院學報，2012，34（2）：26-30.

[9]萬 全，沈保平，孫文賢，等. 長吻精子保存液在人工授精中的應用試驗[J]. 水產養殖，2006，27（3）：4-6.羅慶華，謝 堅，李 捷，等. 全球變化背景下中國大鯢生態繁育工程的結構與功能分析[J]. 江蘇農業科學，2015，43（10）：292-295.endprint