2種乙烯抑制劑對連作地黃生長的影響

李娟　申軍艷　陳楓　聶銘　王俊　王豐青　陳新建　張重義

摘要：通過對地黃生長過程中乙烯合成及轉運途徑的干擾，減輕地黃化感自毒作用的效果，為消減地黃連作障礙提供理論依據和技術支持。在地黃重茬地塊選取6個小區，分別以乙烯合成抑制劑氨氧乙酸（AOAA）、乙烯受體抑制劑1-甲基環丙烯（1-MPC）的3個濃度進行處理，并選取正茬、重茬地黃作為對照，根據地黃的死亡率、生長指標、相對電導率、超氧化物歧化酶（SOD）活性、根系活力等指標探討阻斷植株體內乙烯釋放對連作地黃生長的影響。結果表明，經乙烯抑制劑1-MCP、AOAA處理的地黃植株，與重茬對照植株相比死亡率明顯降低、相對電導率減小、超氧化物歧化酶活性增加、根系活力增加、植株生長狀況得到改善。乙烯抑制劑1-MCP、AOAA對地黃生長過程中乙烯的合成途徑造成干擾，從而減輕地黃連作障礙。

關鍵詞：地黃；連作障礙；乙烯；氨氧乙酸（AOAA）；1-甲基環丙烯（1-MCP）

中圖分類號： S567.23+9.04 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0332-04

連作障礙即重茬問題，已嚴重影響我國藥用植物的生產及產業化進程，據統計，藥用植物中約70%的根類藥材在生產中均存在連作障礙[1]。地黃（Rehmannia glutinosa L.）為玄參科多年生草本植物，是我國著名的“四大懷藥”之一，也是根類藥材中連作障礙最為嚴重的典型代表之一。地黃種植1年之后需隔8～10年方可再種，連作時可表現為植株生長不良，塊根不能正常膨大，產量、品質明顯下降，甚至絕收[2]。為探究地黃連作障礙的產生原因和機理，通過土壤環境監測、植株生理生化指標測定、正茬及重茬地黃cDNA差異轉錄組文庫的構建、響應地黃連作障礙關鍵基因和特定miRNAs的篩選鑒定，基本確定了“化感物質→鈣信號傳導途徑→乙烯產生→染色質修飾→基因表達抑制→DNA、RNA、蛋白質合成受阻→植物傷害表現”，這可能為地黃體內涉及連作毒害信號的感知、傳導、響應、效應的“毒害機理”[3-8]。

前期研究證明，鈣信號系統與乙烯合成系統的關鍵基因在連作地黃中均得到了高水平表達[9]。通過研究鈣信號調控對地黃連作障礙的影響，探索地黃連作障礙的消減技術。結果表明，經IP3抑制劑、鈣釋放通道抑制劑處理后，鈣信號響應元件的CBL、CBP、CIBP、PLC等關鍵基因的表達均顯著下調；對不同處理植株表型的調查也表明，鈣阻斷后的植株生物量顯著高于未被阻斷的對照植株[10]。目前，基于植物鈣信號調節的化學調控大多處于理論研究階段。乙烯是一種重要的內源性植物激素，具有生物活性和復雜的生物學功能，并調節植物生長發育和許多生理生化過程，也被認為是一種脅迫應答激素，其合成及信號傳導途徑已在很多植物中被證實[11-12]。利用乙烯抑制劑對抗植物早熟，從而延長存放時間，已被廣泛應用于果蔬、花卉保鮮行業[13-15]。本研究利用乙烯抑制劑控制連作地黃生長過程中乙烯的釋放，從而切斷化感自毒物質的信號傳導過程，以減輕地黃連作障礙。

為證明關于連作障礙“毒害機理”的推斷，探明干擾乙烯合成及釋放途徑對連作地黃生長的影響，以連作地黃為試驗材料，外援施加乙烯合成抑制劑氨氧乙酸（AOAA）、乙烯受體抑制劑1-甲基環丙烯（1-MCP），從而控制重茬地黃體內乙烯的含量，測定受試地黃的產量、死亡率、相對電導率、超氧化物歧化酶（SOD）活性、根系活力等指標，以期闡明地黃連作障礙的作用機理，為消減技術體系的建立提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

供試地黃品種為溫85-5；塊根繁殖材料蘆頭（種栽）由溫縣農業科學研究所提供，經河南農業大學高致明教授鑒定為地黃（Rehmannia glutinosa L.）。氨氧乙酸（AOAA）購自西安永泰生物科技有限公司，1-甲基環丙烯（1-MCP）購自蘭州嘉誠生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

試驗于2013年4—10月在溫縣農業科學研究所試驗田內進行。供試塊根大小一致、部位相同，種植前經多菌靈浸種處理。于地黃種植后70 d開始試驗，AOAA濃度設1.00、0.50、0.25 mmol/L，分別進行灌根；1-MCP濃度設0.20、010、0.05 g/L，于塑料棚內熏蒸處理12 h，為防止高溫期密閉傷害，熏蒸處理于傍晚至翌日清晨進行。每個濃度選擇20株地黃進行處理，每隔1周處理1次，共處理6次，另設正茬、重茬地黃作為對照。每次處理前調查受試地黃的死亡率，并測定其地上部直徑作為生長指標。從首次處理后1周開始，測定受試地黃葉片的SOD活性和相對電導率。于最后1次處理結束后1周進行采收。

1.3 測定項目

每次處理前，記錄地黃地上部直徑、死亡植株數量，并測定其SOD活性和相對電導率。SOD活性的測定參照文獻[16]，并進行改良；相對電導率的測定參照文獻[17]。以上生理指標每個處理取樣10株，剪取地黃植株地上部分進行測定，重復測定3次。于最后一次處理結束后1周進行采收，采收時測定地黃的根系活力、地上部分鮮質量、地下部分鮮質量。根系活力的測定參照鄭堅等的方法[18]，重復3次。

采用IBM SPSS 19.0軟件對試驗數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 乙烯抑制劑對連作地黃死亡率及生長指標的影響

由圖1可知，乙烯抑制劑處理對連作地黃的死亡率影響較大，采收時死亡率為0.25 mmol/L AOAA>0.05 g/L 1-MCP>重茬>0.50 mmol/L AOAA>1.00 mmol/L AOAA>020 g/L 1-MCP>0.10 g/L 1-MCP >正茬。1.00 mmol/L AOAA處理的植株，前期死亡率高于未經處理的重茬地黃，第4次處理前死亡率已低于重茬地黃；0.50 mmol/L AOAA處理的植株，前期死亡率接近于重茬地黃，第4次處理后死亡率開始低于重茬地黃；0.10 g/L 1-MCP處理的植株，前期死亡率接近于重茬地黃，第3次處理后死亡率開始低于重茬地黃；020 g/L 1-MCP處理的植株，死亡率始終低于重茬地黃，表明1-MCP處理對抑制連作地黃乙烯釋放具有更好、更快的效果。然而，在0.25 mmol/L AOAA、0.05 g/L 1-MCP處理組，第1次施藥后1周的死亡率高于重茬地黃，且整個生長期的死亡率均高于重茬地黃，至采收時死亡率達100%。可見，低濃度乙烯抑制劑不能減緩地黃的連作障礙，反而在一定程度上增加其連作發病率，這與廣泛存在于生物生長發育過程中的Hormesis效應相吻合。Hormesis效應別稱小劑量刺激效應，即很多化合物在不同濃度時出現的“低促高抑”現象[19]。試驗結果表明，施加低濃度乙烯抑制劑反而刺激了受試地黃乙烯的釋放，致使連作地黃的死亡率增加。endprint

由圖2可知，乙烯抑制劑對受試地黃地上部直徑的影響較小，不同濃度、類型的乙烯抑制劑均可在一定程度上提高受試地黃的地上部直徑，且各濃度1-MCP的處理效果優于同等濃度的AOAA，但遠未達到正茬地黃的水平，且與重茬地黃的地上部直徑差異不顯著。正茬地黃、重茬地黃的地上部直

徑最高值分別出現于8月23日、8月16日，而經乙烯抑制劑處理的受試地黃，其地上部直徑最高值的出現日期與正茬地黃一致或更晚。可見，重茬地黃存在早衰現象，而乙烯抑制劑可在一定程度上能緩解早衰。

乙烯抑制劑對受試地黃的地上、地下鮮質量影響較大，其塊根鮮質量依次為正茬>1.00 mmol/L AOAA>0.20 g/L 1-MCP>0.50 mmol/L AOAA>0.10 g/L 1-MCP>重茬（表1）。經1.00 mmol/L AOAA處理的受試地黃，其存活植株的地下塊根鮮質量平均值為100.5 g，幾乎達到正茬地黃的水平，與重茬地黃差異極顯著，連作障礙消減率達62.8%；其次為0.20 g/L 1-MCP處理組，其平均地下塊根鮮質量為54.1 g，與重茬地黃差異顯著，連作障礙消減率達32.5%。

2.2 乙烯抑制劑對連作地黃SOD活性的影響

SOD活性的高低代表植物抵御逆境能力的大小。由表2可知，正茬和經過處理的受試地黃的SOD活性均呈先增強、后減弱、再增強的趨勢。于首次施用乙烯抑制劑后1周進行第1次測量，經處理的受試地黃SOD活性均大幅高于重茬地黃，并接近或高于正茬地黃，此趨勢保持至8月9日（第2次施用后1周）；之后，所有受試地黃的SOD活性均顯著降低，且同期正茬、重茬地黃的SOD活性均有所降低，死亡率持續上升，此期恰為地黃生育期中各種病害的高發期。8月30日之后，正茬和經高濃度、中濃度乙烯抑制劑處理的受試地黃，其SOD活性又增強至正常水平。試驗結果表明，乙烯抑制劑AOAA、1-MCP處理能夠切斷植株對化感自毒物質的響應程序，增強SOD活性，從而減輕地黃連作障礙。

2.3 乙烯抑制劑對連作地黃細胞膜透性的影響

細胞膜透性的增加與很多逆境因素有關，其數值的大小標志著逆境的強弱，也標志著植株的抗逆能力。在本試驗中，地黃的細胞膜透性由葉片的相對電導率表示。由表3可知，正茬地黃相對電導率的變化趨勢為先降低后升高再降低，于8月9日開始升高，至8月16日出現1個高峰期，相對電導率達到69.1%，但在8月23日很快回落至25.8%，表明此期間是地黃生長過程中逆境最嚴重的時期，但脅迫時間較短，傷害較小，地黃尚可恢復至正常水平。經0.20、0.10 g/L 1-MCP處理的受試地黃植株，其相對電導率的變化趨勢與正茬地黃相似，受試植株的電導率于8月16日達到高峰值后可較快恢復至正常水平。而經AOAA處理的受試地黃，其相對電導率的變化趨勢更接近于重茬地黃，恢復能力相對較慢。重茬地黃的相對電導率最高值出現于8月16日，達到79.7%，但其相對電導率在整個生長過程中均處于較高水平，始終高于正茬地黃，表明重茬地黃不僅受到生長過程中短暫的溫度、干濕度、病蟲害等環境脅迫，而始終處于逆境脅迫的環境中。

2.4 乙烯抑制劑對連作地黃根系活力的影響

前期研究結果表明，地黃根區土壤中潛在的化感物質抑制了地黃根系的生長，使根系呼吸作用減弱、脫氫酶活性減弱，根系活力越小則地黃連作障礙越嚴重[20]。在本試驗中，正茬地黃的根系活力明顯高于重茬地黃，根系活力值依次為正茬>1.0 mmol/L AOAA>0.2 g/L 1-MCP>0.1 g/L 1-MCP>0.5 mmol/L AOAA>重茬。施用乙烯抑制劑可提高連作地黃的根系活力，經0.2 g/L 1-MCP、1.0 mmol/L AOAA處理的連作地黃根系活力值分別提高至1.457、1.425 μg/（g·h），接近正茬水平（表4）。

3 結論與討論

在連作過程中，地黃對化感自毒物質具有感知、傳導、響應、效應幾個關鍵階段，化感物質所引起的基因和蛋白的異常表達是地黃連作障礙的根本原因。前期研究發現，乙烯前體SAM合成酶1Z71、ACC氧化酶1V38在重茬地黃中顯著上調，兩者均在根部高水平表達，且高峰期出現在塊根膨大期，由此推測這2種酶均是產生乙烯的關鍵酶，而乙烯可能是引起地黃連作障礙的直接原因[9]。本研究通過試驗證明，施用乙烯阻斷劑1-MCP、AOAA可增加地黃的抗逆性，減輕地黃連作障礙。

目前，生產中主要采用3種方式進行乙烯調控。利用乙烯清除劑，通過吸收乙烯氣體從而降低環境中乙烯的濃度；利用乙烯合成抑制劑，從乙烯生物合成過程S-腺苷蛋氨酸（SAM）-氨基環丙烷羧酸（ACC）-乙烯（Eth）中的2個關鍵步驟來抑制合成；利用乙烯作用抑制劑競爭植物體內的受體，通過其與乙烯受體可逆或不可逆地結合，阻礙乙烯與受體的正常結合，進而抑制其所誘導的生理生化過程[21]。由于連作地黃主要是化感自毒物質引起的內源乙烯增加，本研究選取乙烯合成抑制劑AOAA、乙烯受體抑制劑1-MCP對乙烯進行調控。結果表明，低濃度的1-MCP（0.05 g/L）、AOAA（0.25 mmol/L）處理可增加地黃的連作障礙；中、高濃度的1-MCP（0.10～0.20 g/L）、AOAA（0.50～1.00 mmol/L）處理對地黃的連作障礙具有一定的消減效應，作用效果隨施加濃度的增加而逐漸增強。

雖然AOAA可減少植物內源乙烯的釋放，但對環境中的乙烯卻無能為力，因此在實際生產中具有一定的局限性。1-MCP 是近年來發現的一種新型乙烯受體抑制劑，通過與乙烯受體的不可逆結合抑制內源乙烯的生理效應，并抑制外源乙烯對內源乙烯的誘導作用，目前已作為STS的替代品在國內外大規模使用[13-15]。本試驗中，經1-MCP處理的受試植株在成活率、地上部直徑、葉片SOD活性、相對電導率等方面的作用效果均優于AOAA處理，但其地下塊根生物量卻明顯低于AOAA處理，這可能與化感自毒物質的作用部位及方式有關。前期試驗中，根據乙烯合成關鍵酶的表達水平、表達部位推斷，連作地黃根部產生的乙烯通過維管組織運送至地上部，從而表現出相應毒害作用并引起早衰現象[9]。在本試驗中，AOAA處理直接作用于植株根部，而1-MCP在自然狀態下為氣態，需在密閉空間中使用，因此1-MCP處理采用熏蒸方式，更多作用于植株地上部分；AOAA處理直接抑制乙烯形成的源頭，而1-MCP處理主要針對轉運后的結果。endprint

藥用植物的連作障礙極為復雜，且土壤因成分復雜被研究者稱為“黑匣子”，消除連作障礙并對其進行調控絕非易事。本研究證實，通過干擾地黃生長過程中乙烯的合成途徑，能夠阻礙化感自毒物質的信號傳導，進而抑制特異基因的不正常表達，減輕化感自毒物質對植物的毒害作用，消減地黃連作障礙。在抑制地黃乙烯的合成及轉運途徑方面僅進行了探索性研究，尚需對施用方式、施用時間、作用濃度進行深入研究，以便將此方法大規模應用于生產中。隨著對地黃連作障礙分子機理研究的深入，利用轉基因技術培養出抑制乙烯合成的地黃品種，在基因水平上阻斷化感自毒物質的作用，有可能成為更簡單的方式。

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