促排卵對小鼠卵巢組織中缺氧誘導因子-1α的影響

杜秀雅，馬華剛

（1.濰坊醫學院，濰坊 261041；2.濰坊市人民醫院生殖醫學科，濰坊 261041）

卵泡的生長發育過程受多因素相互作用、相互影響，多重調控因子影響其發育過程，其中極為重要的是下丘腦-垂體-卵巢軸及促性腺激素，如FSH、LH。FSH 是卵泡發育必須的激素，其主要生理作用是促進竇前卵泡及竇卵泡顆粒細胞增殖與分化，分泌卵泡液，使卵泡生長發育。LH 主要作用是刺激卵泡膜細胞合成雄激素，主要是雄烯二酮，為E2的合成提供底物。卵泡還受卵巢顆粒細胞分泌的抑制素、激活素、卵泡抑制素及眾多細胞因子和生長因子的調節如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子、成纖維因子、轉化生長因子、血小板衍生生長因子，對下丘腦-垂體-卵巢軸調節及通過其自、旁分泌的作用調節卵泡生長發育。適當的氧濃度對卵泡的生長發育極為重要，研究表明卵巢內氧氣濃度較低，其范圍在1.3%～5.5%左右［1］，卵巢內環境為低氧環境，與低氧有關的因子有很多，其中最靈敏的當屬缺氧誘導因子-1（HIF-1）。

HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物的一種轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β組成，其中HIF-1α是主要的氧調節亞基，可以調節下游靶基因VEGF的轉錄促進血管新生，對細胞適應缺氧狀態至關重要，缺氧對卵母細胞減數分裂過程中染色體分離和復制有重要影響［2］，本研究從蛋白水平檢測了促排卵對小鼠卵巢組織中HIF-1α表達，旨在研究促排卵過程中多卵泡同時發育對卵母細胞氧供的改變及缺氧對卵母細胞質量的影響。

材料與方法

一、實驗動物與分組

清潔級成年雌性昆明小鼠30只，鼠齡6～8周，體重20～25g，由濰坊醫學院動物實驗中心提供。適應性飼養1 周后進入實驗階段，自然光照，自由取水和攝食，陰道涂片檢查動情周期。隨機分為2組：自然排卵組（對照組）、促排卵組（實驗組），每組15只。

二、研究方法

實驗組于動情周期第3天腹腔注射促排卵藥普麗康（50U／0.5ml，歐加農，荷蘭）0.4U／g，注射后48h頸椎脫臼法處死；對照組小鼠進入動情期后（陰道涂片全為無核角化細胞，間或有少量上皮細胞）頸椎脫臼法處死。兩組小鼠處死后取卵巢組織，經4%多聚甲醛固定，脫水，常規石蠟包埋，切片（4 mm），用于免疫組織化學方法檢測小鼠卵巢HIF-1α的表達及定位。

三、小鼠卵巢組織中HIF-1α 表達及定位的檢測

采用辣根過氧化物酶復合物（HRP）免疫組織化學SV（Super Vision）法檢測HIF-1α在小鼠卵巢中的表達及定位，操作按試劑盒（武漢博士德公司）說明書要求進行，將上述切片脫蠟至水，滴加3% 雙氧水，室溫10min 以滅活內源性過氧化物酶，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的浴盒內，在微波爐內加熱（92 ℃～96 ℃）5 min，冷卻至室溫，滴加封閉液，室溫30min以阻斷非特異性的結合。滴加一抗（山羊抗兔HIF-1α單克隆抗體，武漢博士德公司，1∶100 稀釋），4 ℃過夜，滴加二抗（多聚體抗山羊IgG-HRP，武漢博士德公司），37 ℃30min，最后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德公司）顯色。山羊抗兔HIF-1α單克隆抗體用于檢測小鼠卵巢組織中HIF-1α無交叉反應，陽性顯色為棕黃色。每組以PBS代替一抗進行孵育作為陰性對照。

每組任選15只小鼠卵巢切片，經免疫組織化學染色，在卵泡的細胞胞漿或包膜中出現棕黃色顆粒，為陽性細胞，應用Lecia顯微成像系統，高倍鏡（×400）下隨機選取10個視野，應用Image-Pro Plus圖文分析系統計算平均光密度值，采用平均光密度法半定量法比較蛋白的表達強度。

四、統計學分析

平均光密度（AOD）＝累計光密度（IOD）／area。計量資料采用（±s）表示，采用t檢驗比較兩組間均數。采用SPSS 17.0統計軟件進行處理。P 值為雙側概率，檢驗水準α＝0.05。

結 果

一、HIF-1α在小鼠卵巢組織中的表達

HIF-1α蛋白在兩組排卵狀態下小鼠的卵母細胞及顆粒細胞上均有表達（圖1）。

二、平均光密度法半定量比較HIF-1α蛋白的表達

實驗組小鼠竇狀卵泡卵母和顆粒細胞中HIF-1α蛋白AOD 值明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 各組小鼠卵巢卵泡中HIF-1α的表達 免疫組織化學SV 法×100

表1 兩組小鼠卵巢組織HIF-1α蛋白AOD 的比較（±s）

表1 兩組小鼠卵巢組織HIF-1α蛋白AOD 的比較（±s）

注：與對照組相比較，＊P＜0.05

組 別 樣本量（n）AOD對照組10 0.149 5±0.034 7實驗組 10 0.192 4±0.026 8＊

討 論

隨著輔助生殖技術的發展，促排卵治療應用日益廣泛，促排卵導致的多個卵泡同時發育是否會影響卵母細胞的質量引起了人們的擔憂。卵泡的生長發育過程是受多因素相互作用相互影響的，多重調控因子影響其發育過程，極為重要的是下丘腦-垂體-卵巢軸及促性腺激素。卵泡的生長發育還需要適當的氧濃度，與低氧的卵巢內環境有關的缺氧誘導因子-1最靈敏。

HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物的一種轉錄因子，由α和β兩個亞基組成的異源性二聚體。編碼HIF 的基因位于第14號染色體上，是細胞適應缺氧環境的主要調節因子［2］，可以減輕缺氧導致的損害。HIF-1α可以在一定程度上反應氧的濃度，氧濃度越低，HIF-1α水平越高［3］。本研究證明促排卵組小鼠卵巢內HIF-1α水平較自然排卵組明顯增高，正常情況下，HIF-1α通過泛素-蛋白酶體通路降解，HIF-1α通過識別并結合多個76氨基酸泛素多肽，然后迅速運送至26S的蛋白酶體處水解，其半衰期只有數分鐘［4］。促排卵引起多個卵泡同時發育，卵泡周圍氧濃度降低，卵泡長期缺氧，HIF-1α產生的保護性適應機制已不足，導致卵泡中HIF-1α泛素化急劇下降，降解減少，并且在低氧環境下，HIF-1α和HIF-β形成的二聚體變得更加穩定，降解進一步減少，最終導致HIF-1α增加［5］。

已經有很多文獻表明促排卵可以影響卵泡的生長發育：促排卵影響卵母細胞的減數分裂，對其表達修飾過程及生長發育能力均起不良作用［6-7］。不僅如此，促排卵還可導致顆粒細胞的凋亡［7-8］。促排卵引起卵母細胞質量的變化可能是影響了調節其生長發育的因子進而影響其質量。良好的卵母細胞質量是優質胚胎的前提，卵母細胞質量下降勢必導致胚胎質量下降，促排卵是否會增加新生兒出生缺陷的發生仍是人們思考的問題。有文獻表明借助IVFET 助孕技術出生的新生兒先天畸形發生的概率明顯高于自然妊娠出生的新生兒［9］，促排卵獲得較多的卵母細胞是IVF-ET 助孕技術的關鍵步驟，高水平的促性腺激素增加了卵母細胞非整倍體形成的風險，增加了后代先天畸形率。

在體外培養中，高濃度氧環境下生長的卵泡比在低氧濃度培養發育的成熟度高［10］。HIF-1α可以在一定程度上反應卵泡的質量，HIF-1α濃度與卵泡的質量成反比［11］。應用FSH 促排卵可以上調HIF-1的表達，增加HIF-1α的轉錄活性［12］。HIF-1α通過調節下游靶基因VEGF 的轉錄促進血管新生，新生的血管為卵泡提供營養物質，氧氣，甾體激素等。多個卵泡同時發育導致單個卵泡周圍血流量減少，進而導致氧濃度降低，影響卵泡的減數分裂，增加卵母細胞的非整倍體發生率。

綜上所述，HIF-1α表達水平與卵泡質量密切相關，因此可以將HIF-1α表達水平作為評價卵泡質量的指標。通過檢測HIF-1α 水平判斷卵泡的質量，并將此應用到臨床上來評估卵母細胞質量，優先選擇質量高的卵母細胞，提高胚胎質量，減少促排卵引起的新生兒出生缺陷的發生率。

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