姐妹胚胎體外形成囊胚的時間、數量與D3胚胎移植結局關系的研究

尹太郎，丁錦麗，張怡，徐望明，龍文，楊菁

（武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060）

影響IVF-ET 臨床結局的因素較多，胚胎質量是一個重要因素［1］。有研究表明，將鮮胚移植后剩余的所有胚胎行囊胚培養，IVF-ET 后妊娠患者的剩余胚胎更容易形成囊胚，同周期中姐妹胚胎體外形成囊胚的潛能可以預測D3 移植胚胎的臨床結局［2-3］。但關于姐妹胚胎繼續培養形成囊胚的速度與胚胎移植結局的關系鮮有報道。本研究回顧性分析本中心2013年1月至2014年5月卵裂期胚胎移植后剩余的姐妹胚胎繼續囊胚培養的患者數據，研究姐妹胚胎體外形成囊胚的速度與D3胚胎移植后臨床結局的相關性，探索其對移植胚胎的臨床結局的預測作用。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年1月至2014年5月在我院生殖醫學中心于D3行優質新鮮胚胎移植、剩余姐妹胚胎繼續培養并形成囊胚的363 例患者的資料，納入134例鮮胚移植后剩余姐妹胚胎繼續培養無囊胚形成的患者作為對照。女方年齡20～42歲，不孕年限1～15年。不孕原因包括：子宮內膜異位癥、盆腔輸卵管因素、排卵障礙；男方少、弱、畸精子癥及不明原因不孕。

二、治療方法回顧

1.促排卵及受精：采用我中心常規使用的方案促排卵，包括短方案、長方案及超長方案［4］。陰道B超發現3個以上直徑≥18mm 的卵泡時，肌注5 000～10 000U HCG（雪蘭諾，瑞士），36h后在陰道B 超下采卵。根據男方精子質量決定自然受精或卵胞漿內單精子注射授精。

2.胚胎移植：所有患者均根據其年齡、內膜準備情況等決定移植卵裂期胚胎數，移植2～3枚優質胚胎。在移植后肌注黃體酮行黃體支持，具體參考本中心用藥方案［5］。

3.囊胚培養及凍存：將第3天移植后剩余的非優質胚胎置入Quinn’s囊胚培養液（SAGE，美國）繼續囊胚培養。D5／D6評估形成囊胚的情況，將形成的囊胚冷凍。

4.胚胎質量評估：根胚胎形態學對D3胚胎進行評估，即評估時包含6個以上均勻一致的卵裂球且細胞碎片小于20%的胚胎定義為優質胚胎，其余為非優質胚胎［5］。按Gardner囊胚分級法［6］對D5／D6胚胎進行評分。

三、分析指標

本項研究收集了納入研究的女性的年齡、不孕年限、體重指數（BMI）、移植優胚數、胚胎種植數、臨床妊娠例數以及剩余胚胎囊胚培養情況等資料。

胚胎移植后14d檢測血β-HCG＞10U／L，2周后B 超下見孕囊確定為臨床妊娠，孕28 周前妊娠丟失為早期流產。胚胎種植率定義為超聲掃描可見孕囊數／移植胚胎數；臨床妊娠率定義為臨床妊娠例數／總周期數；流產率為流產例數／臨床妊娠例數；多胎率為多胎例數／臨床妊娠例數（本研究中均為雙胎）；囊胚形成率為D5或／和D6形成的囊胚數／行囊胚培養的姐妹胚胎數。

四、統計學分析

應用SPSS 19.0統計學軟件進行分析。計量資料結果以均數±標準差表示，計數資料以率表示。定量資料比較采用t檢驗，定性資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、基本資料

共納入497個周期的患者資料，按姐妹胚胎培養后是否有囊胚形成分組，再根據觀察囊胚形成的時間分為D5組和D6組。若D5和／或D6有囊胚形成，則為囊胚形成組，反之為對照組；僅D5有囊胚形成為D5組，僅D6有囊胚形成為D6組，D5、D6均有囊胚形成為D5＋D6組。本研究中囊胚形成組363例，其中D5組107例，D6組144例，D5＋D6組112例。

囊胚形成組與對照組及D5、D6、D5＋D6 三個亞組與對照組組間女方年齡、不孕年限、不孕類型均無統計學差異（P＞0.05）；囊胚形成組的優質胚胎數（5.00±2.78）顯著高于對照組（4.25±2.67）（P＜0.01），D5、D5＋D6 兩個亞組的優質胚胎數（分別為5.08±2.92，5.40±2.83）也顯著高于對照組（4.25±2.67）（P＜0.05），D5＋D6組的優質胚胎數還顯著高于D6組（P＜0.05），而D5組的優質胚胎數（5.08±2.92）雖高于D6組（4.64±2.59），但差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

二、姐妹胚胎形成囊胚的情況與D3 胚胎移植結局的關系

囊胚形成組與對照組及D5、D6、D5＋D6 三個亞組與對照組組間移植的胚胎數無統計學差異（P＞0.05）。囊胚形成組與對照組的種植率（31.34% vs.19.41%）及 臨 床 妊 娠 率（50.14%vs.32.84%）均有統計學差異（P＜0.01）；D5、D6及D5＋D6 三 個 亞 組 種 植 率（分 別 為34.42%、29.01%、31.42%）及臨床妊娠率（分別為53.27%、47.92%、50.00%）均 顯 著 高 于 對 照 組（分 別 為19.41%、32.84%）（P＜0.01和P＜0.05）；囊胚形成組與對照組及D5、D6、D5＋D6三個亞組與對照組的組間流產率均無統計學差異（P＞0.05）（表2）。

三、姐妹胚胎囊胚形成個數與D3 胚胎移植結局的相關性

在363個有囊胚形成的周期中，形成囊胚的個數為1～10個。

線性回歸分析結果顯示，在形成0～7個囊胚的周期患者中，形成囊胚的個數與鮮胚種植率及臨床妊娠率呈顯著正相關（r＝0.749，P ＜0.05；r＝0.752，P＜0.05）（表3）。

形成8個囊胚者有2例，9個囊胚者1例，10個囊胚者1 例。該4 個周期共植入胚胎8 枚，著床3枚（種植率37.50%），臨床妊娠3例（臨床妊娠率75.00%）。由于例數較少，故未列入相關性分析。

四、非優質胚胎數≥5的周期姐妹胚胎形成囊胚的情況與移植結局的關系

由于患者繼續囊胚培養的非優質胚胎數量存在差別，少者僅有1個，多者有20個，為了避免繼續囊胚培養的非優質胚胎基數不同為研究結果帶來的干擾，我們進一步選擇至少有5個非優質胚胎行繼續培養的共382例患者作為研究對象，按照囊胚形成率進行分組：囊胚形成率≥40%為A 組，囊胚形成率20%～40%為B組，囊胚形成率＜20%為C組。

表1 患者基本資料［（±s），n（%）］

表1 患者基本資料［（±s），n（%）］

注：與對照組比較，＊P＜0.01，＊＊P＜0.05；與D5＋D6組比較，＃P＜0.05

組 別 周期數 年齡（歲） 不孕時間（年） 優質胚胎（枚）原發不孕對照組 134 30.81±4.46 4.32±2.93 4.25±2.67 78（58.21）囊胚形成組 363 30.36±4.22 4.64±3.40 5.00±2.78＊ 178（49.04） D5組 107 30.57±4.37 4.24±3.41 5.08±2.92＊＊ 51（47.66） D6組 144 30.44±4.11 4.89±3.21 4.64±2.59＃ 76（52.78） D5＋D6組 112 30.06±4.24 4.70±3.61 5.40±2.83＊ 51（45.56）

A、B及C 組組間女方年齡及移植胚胎數均無統計學差異（P＞0.05）。A 組的種植率及臨床妊娠率均顯著高于B 組和C 組（P＜0.05）；B 組的種植率及臨床妊娠率較C 組有增高趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）；A、B 及C 組組間的流產率及多胎率均無統計學差異（P＞0.05）（表4）。

表2 姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s）

表2 姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.01，＊＊P＜0.05

組 別 周期數 移植胚胎數 種植率（%） 臨床妊娠率（%） 流產率（%）對照組 134 2.02±0.19 19.41（53／273） 32.84（44／134） 13.63（6／44）囊胚形成組 363 2.02±0.15 31.34（230／734）＊ 50.14（182／363）＊ 15.38（28／182） D5組 107 2.00±0.10 34.42（74／215）＊ 53.27（57／107）＊ 10.52（6／57） D6組 144 2.04±0.18 29.01（85／293）＊ 47.92（69／144）＊＊ 14.49（10／69） D5＋D6組 112 2.02±0.13 31.42（71／226）＊ 50.00（56／112）＊ 10.71（6／56）

表3 D3胚胎移植結局與姐妹胚胎囊胚形成個數的關系（%）

表4 非優質胚胎數≥5的周期姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s，%）

表4 非優質胚胎數≥5的周期姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s，%）

注：與A 組比較，＊P＜0.05，＃P＜0.01

組 別 周期數 年齡（歲） 移植數（枚）種植率 臨床妊娠率 流產率 多胎率A 組 46 29.35±4.19 2.02±0.15 43.01（40／93） 67.39（31／46） 22.58（7／31） 29.03（9／31）B組 139 30.35±3.75 2.03±0.17 29.43（83／282）＊ 47.48（66／139）＊ 16.67（11／66） 24.76（17／66）C組 197 30.69±4.49 2.02±0.14 23.12（92／398）＃ 38.58（76／197）＃ 10.53（8／76） 21.05（16／76）

討 論

隨著不孕夫婦對人類輔助生育技術需求的增加，如何在提高臨床妊娠率的同時也減低多胎妊娠的風險是生殖醫學普遍關注的問題。囊胚移植較D3胚胎移植有更好的臨床結局，但周期取消的風險較大，所以部分中心選擇在D3 移植優質胚胎后將剩余的胚胎繼續培養成囊胚后凍存，等待凍胚移植。對于姐妹胚胎體外培養的囊胚形成率及囊胚形成個數是否可以預測移植胚胎的發育、種植潛能尚無統一結論。

多項研究表明，姐妹胚胎體外培養的囊胚形成率及囊胚形成個數可以用于預測D3胚胎移植的臨床結局［3，7-8］。本研究回顧性分析了2013年1月至2014年5月在本中心行D3優質胚胎移植，且剩余胚胎繼續培養的497個周期的數據，在不孕時間、女方年齡、不孕類型、移植胚胎數等基礎資料無顯著差異的情況下，姐妹胚胎繼續培養有囊胚形成組患者的種植率和臨床妊娠率均顯著高于對照組，其中D5、D6有囊胚形成的患者其D3移植周期的種植率及臨床妊娠率也顯著高于對照組。從趨勢上看，D5組鮮胚移植后的種植率及臨床妊娠率均高于D6組和D5＋D6組，且D5＋D6組的種植率及臨床妊娠率較D6組也有增高趨勢。D3 移植胚胎的種植率及臨床妊娠率均與姐妹胚胎培養形成囊胚的個數呈正相關。我們推測，囊胚形成組及亞組的種植率及妊娠率較無囊胚形成組高，可能的原因之一是有囊胚形成的患者其胚胎質量較好，正如本文表1所示，囊胚形成組及各亞組較無囊胚形成組獲得的優質胚胎數更多。為了進一步探索姐妹胚胎的囊胚形成率與D3移植結局的相關性，我們將研究對象（囊胚培養的非優質胚胎數≥5）按囊胚形成率分為3組（≥40%為A 組，介于20%～40%為B 組，＜20%為C組），統計結果顯示，A 組的D3 胚胎移植周期種植率及臨床妊娠率顯著高于B組及C 組，B組較C 組也有升高趨勢，表明姐妹胚胎囊胚形成率高的患者，D3移植后有較好的臨床結局，與早先的報道［9-10］結論一致。

發育速度較快的胚胎其存活能力更高，胚胎的發育速度可能用于預測其種植潛能［11-13］，在一定程度上可能是由于發育較慢的胚胎非整倍體的發生率更高［14］。結合本項研究結果，我們推測，姐妹胚胎的發育速度也可能用于預測D3胚胎移植后的臨床結局。胚胎在體外培養時間的延長可能選擇出更有發育潛能的胚胎。有文獻報道，發育潛能較差的胚胎可能停滯在基因組激活的卵裂期階段，體外繼續培養后能夠形成囊胚的胚胎，其染色體異常的比例更低［15］。胚胎質量、卵母細胞質量及培養環境等均可影響囊胚形成，其中以卵裂期胚胎的質量尤為重要，它不僅影響形成的囊胚的質量，也影響囊胚的形成率［16］。

卵裂期胚胎內在質量可能直接決定其發育潛能［17］，從而影響胚胎移植后的臨床結局。一般而言，D3 移植的胚胎都是同期獲得的胚胎中質量較好、形態學評分較高的胚胎，因此，剩余姐妹胚胎體外培養成囊胚的能力就可能間接反映D3移植胚胎在體內發育的潛能及其臨床結局［9］。在我們的研究中，姐妹胚胎有囊胚形成組較無囊胚形成的對照組D3移植后有較好的胚胎種植率及臨床妊娠率，因此，我們認為，姐妹胚胎體外培養形成囊胚的能力也可以間接反應D3移植胚胎在體內發育的潛能及其臨床結局，這與國內外多項研究結果一致［3，8-10］。關于剩余胚胎形成囊胚的能力對臨床妊娠的預測作用，國外數據研究表明，其陰性預測率為82%，陽性預測率為60%［18-19］。

囊胚的發育速度可以預測胚胎的著床潛能，發育速度越慢，妊娠率則越低［20］。Alfarawati等［14］活檢滋養層細胞對囊胚進行染色體分析后發現，發育遲緩的囊胚，其非整倍體的發生率更高。本研究結果提示，囊胚形成各亞組（D5 組、D6 組及D5＋D6組）患者的胚胎種植率及臨床妊娠率均顯著高于對照組，各亞組間的種植率及臨床妊娠率雖無統計學差異，但D5 組較D6 組及D5＋D6 組均有升高趨勢，且D5＋D6組較D6組也有增高趨勢，我們認為姐妹胚胎培養形成囊胚的速度也能預測D3移植后的臨床結局。

姐妹胚胎繼續培養形成囊胚的個數也與D3移植胚胎的種植率及臨床妊娠率相關。有研究表明，單囊胚移植后剩余胚胎繼續培養后冷凍，冷凍的囊胚個數與種植率及活嬰出生率顯著相關，且種植率及活嬰出生率隨著冷凍囊胚個數的增加而增加［8，10］。在本研究中，姐妹胚胎繼續培養形成囊胚的個數在1～10個之間，由于囊胚數＞7個的周期只有4個，故未納入進行相關性分析。我們的結果顯示，姐妹胚胎形成囊胚的個數與D3 移植胚胎的種植率及臨床妊娠率顯著正相關。這與Hill等［8］提出的“形成囊胚的個數也與胚胎種植率和臨床妊娠率呈顯著正相關”結論一致。本研究中，囊胚個數為6時，種植率及臨床妊娠率均達到了最大值，分別為71.43%和100.00%。囊胚數＞7 的4 個周期中，種植率及臨床妊娠率有所下降，但本研究納入的囊胚數＞7的周期數較少，可能不能反映姐妹胚胎形成囊胚的個數與D3 移植胚胎的臨床結局的相關性。

這項研究還存在一定的局限性。因為用于繼續培養的非優質胚胎數量可能存在差異，而這些差異可能影響囊胚形成的比例。因此，我們進一步對非優質胚胎數≥5的患者進行了研究，但是，針對姐妹胚胎體外形成囊胚的數量與D3胚胎移植結局的相關性分析還需要更大樣本量的研究。

總之，本研究結果表明，姐妹胚胎繼續培養后形成囊胚的能力、個數與速度與D3 移植胚胎的種植潛能和發育潛能有關，同周期姐妹胚胎體外形成囊胚的能力個數與速度成為除卵裂期胚胎形態學評估以外的又一預測D3移植胚胎的臨床結局的有效預測因子。對于D3移植失敗但姐妹胚胎培養成為囊胚的患者，可能更需要關注體內激素環境、黃體功能支持及子宮內膜容受性等胚胎以外的原因［21］，以期獲得妊娠。

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