核桃楸成熟合子胚無菌萌發(fā)條件的研究

張海峰，張建瑛，葛文志，祁永會(huì)

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱 150081)

核桃楸成熟合子胚無菌萌發(fā)條件的研究

張海峰，張建瑛，葛文志，祁永會(huì)*

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱 150081)

摘要[目的]研究適合核桃楸在無菌條件下萌發(fā)而獲得無菌植株的方法。[方法] 以成熟核桃楸合子胚為試材，探討不同外植體、基本培養(yǎng)基、激素、蔗糖對(duì)核桃楸無菌萌發(fā)的影響。[結(jié)果] 以帶2片子葉的核桃楸合子胚為外植體，在MS+BA 2.5 mg/L或MS+BA 2.5 mg/L +IBA 0.01 mg/L上萌發(fā)效果最好。[結(jié)論] 適宜的萌發(fā)條件可促進(jìn)核桃楸萌發(fā)，提高萌發(fā)率。

關(guān)鍵詞核桃楸；無菌萌發(fā)；合子胚

核桃楸(Juglans mandshuricaMaxim.)又稱胡桃楸、山核桃、核桃楸子，隸屬于胡桃科胡桃屬，是黑龍江省重要的用材林樹種；同時(shí)核桃楸樹的葉、花、枝、根以及核桃殼都可入藥，核桃楸的種仁營養(yǎng)豐富，能直接食用，果仁油脂豐富，能提煉高級(jí)保健食用油[1]。此外，核桃楸是重要的滋補(bǔ)中藥，果核還是加工高級(jí)工藝品的好原料，還可利用其制作各種工藝花瓶、木貼畫，具有很高的觀賞價(jià)值和收藏價(jià)值，發(fā)展核桃楸經(jīng)濟(jì)林具有很好的經(jīng)濟(jì)效益，市場(chǎng)前景廣闊。

目前，核桃楸遭到過量砍伐，森林面積急劇縮減，現(xiàn)殘存大樹已很稀少。核桃楸由于天然雜交能夠形成許多復(fù)雜群體，種性差異很大[2-3]。用種子繁殖很難保持其優(yōu)良特性，嫁接繁殖效率更低。組織培養(yǎng)技術(shù)能夠?yàn)橹参锟焖俜敝程峁┯行У摹⒈憬莸男峦緩健o菌體系的建立是進(jìn)一步開展組織培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，一般是通過種子在無菌條件下萌發(fā)而獲得無菌植株的方法而建立的。為了進(jìn)一步探索核桃楸快繁技術(shù)，尋找一條最佳的工藝流程，筆者在前期工作的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究了核桃楸成熟合子胚無菌萌發(fā)的條件，以便更加有效地保存核桃楸優(yōu)良基因資源，并使之迅速擴(kuò)大發(fā)展，從而更好的開發(fā)利用。

1材料與方法

1.1材料核桃楸種子采自2013年黑龍江省興隆林業(yè)局核桃楸林。

1.2方法

1.2.1果實(shí)表面除污與滅菌。采取成熟的核桃楸種子，經(jīng)清水洗滌后，在陽光下晾曬將核桃楸外表皮去除掉，放置于溫度20～25 ℃下干燥、通風(fēng)處備用。用錘子將外殼打碎，取核桃楸種子尖部端帶少量子葉的合子胚。先用70%乙醇浸潤30s，2次，然后用0.1%的升汞溶液消毒15min，用無菌水沖洗5～7次，然后在無菌水中浸泡2～4h，備用。

1.2.2接種。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取出表面滅菌后的合子胚，用無菌濾紙吸干其表面多余的水分，用無菌解剖刀去除表皮，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上。

1.2.3外植體對(duì)核桃楸成熟合子胚萌發(fā)的影響。采用2片子葉、1片子葉、不帶子葉的外植體，接種在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，定期觀察記錄。

1.2.4基本培養(yǎng)基及其蔗糖濃度對(duì)核桃楸成熟合子胚萌發(fā)的影響。采用雙因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3種培養(yǎng)基(MS、1/2MS、DKW)及4種蔗糖濃度(10、20、30、40g/L)共計(jì)12種處理組合。將滅菌處理過的外植體接種到上述培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計(jì)核桃楸成熟合子胚的萌發(fā)率及生長狀況。

1.2.5激素對(duì)核桃楸成熟合子胚萌發(fā)的影響。設(shè)置BA(0、1.0、1.5、2.0mg/L)和IBA(0、0.5、1.0mg/L)激素組合，以不加激素的培養(yǎng)基為對(duì)照。將滅菌處理過的外植體接種到上述培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計(jì)核桃楸成熟合子胚的萌發(fā)率及生長狀況。

1.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中添加6g/L瓊脂，pH5.6～5.8。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強(qiáng)度1 500lx，光照時(shí)間10～12h/d。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體對(duì)核桃楸成熟胚生長的影響由表1可知，不同外植體對(duì)核桃楸合子胚的萌發(fā)生長狀況也有所不同。接種7d后，大多數(shù)帶1片、2片子葉的成熟合子胚都開始子葉轉(zhuǎn)綠、膨大，不帶子葉的成熟合子胚在接種7d后變化不大。接種后第14～21天合子胚進(jìn)入了生長快速期，帶2片子葉的外植體上胚軸和胚根迅速生長，幼葉展開。14d時(shí)，上胚軸迅速伸長，胚根開始伸長，胚軸與胚根處顏色發(fā)紅，幼葉呈卷曲狀包被。21d時(shí)，苗高1～2cm，主根伸長且呈紅粉色，葉片伸展。接種28d后，不帶子葉的外植體多數(shù)未萌發(fā)，少數(shù)帶1片子葉外植體萌發(fā)，成苗過程緩慢且成苗率低于13.3%，接種28d后帶2片子葉的外植體幼苗生長健壯，苗高3cm左右，葉片3～4 片，呈嫩綠色，胚根形成主根并帶有側(cè)根。可見，從萌發(fā)成苗情況看，以帶2片子葉的外植體接種效果最好。不帶子葉的外植體絕大部分已經(jīng)褐化死亡，這可能是由于材料褐化和營養(yǎng)供給不足造成的。

表1　不同子葉片數(shù)成熟合子胚接種7 d萌發(fā)情況

2.2基本培養(yǎng)基對(duì)核桃楸成熟胚萌發(fā)生長的影響由表2可知，接種30d后，基本培養(yǎng)基對(duì)合子胚萌發(fā)有較大影響，基本培養(yǎng)基MS對(duì)合子胚萌發(fā)效果最好，合子胚的萌發(fā)率最高，為81.3%，與其余處理間存在顯著差異，從培養(yǎng)基成分看，不同培養(yǎng)基上萌發(fā)率大小為MS>DKW> 1/2MS。從蔗糖濃度看，其萌發(fā)率隨蔗糖濃度增加表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì)。在蔗糖濃度為30g/L時(shí)，萌發(fā)率都在70%以上，平均苗高約 4cm，長勢(shì)健壯；蔗糖濃度為20g/L時(shí)核桃楸成熟合子胚苗高僅次于蔗糖濃度為30g/L的苗高；蔗糖濃度為10g/L時(shí)，幼苗生長，苗高較低；蔗糖濃度為40g/L時(shí)，幼苗生長緩慢。可見，蔗糖濃度為30g/L時(shí)適合核桃楸成熟合子胚無菌萌發(fā)。綜合分析，當(dāng)培養(yǎng)基為MS、蔗糖濃度為30g/L時(shí)，核桃楸成熟合子胚的萌發(fā)率及幼苗生長狀況最好。

表2　培養(yǎng)基對(duì)核桃楸成熟合子胚萌發(fā)的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.36-BA和IBA對(duì)核桃楸成熟合子胚萌發(fā)生長的影響由表3可知，6-BA能夠促進(jìn)核桃楸成熟合子胚的萌發(fā)，隨著6-BA濃度的增加，濃度為 2.5mg/L時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)76.6%和77.3%，差異不顯著，但不添加IBA時(shí)，幼苗后期生長不良，葉片枯黃。隨著IBA濃度的增加，其胚軸基部腫大并愈傷化；在 6-BA濃度為 2.5mg/L和IBA濃度為 0.1mg/L時(shí)，萌發(fā)率為63.7%，幼苗出現(xiàn)葉片干枯、脫落以致全株死亡的現(xiàn)象，這可能是 6-BA和IBA濃度過大導(dǎo)致幼苗生長不良。

表3不同濃度 6-BA和IBA的DKW培養(yǎng)基核桃楸成熟合子胚培養(yǎng)狀況

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3結(jié)論與討論

(1)核桃楸屬于難萌發(fā)種子，一般播種后60～90d才能發(fā)芽出土，有的甚至到翌年才能出土[4]。目前用露天埋藏催芽法，最短也需要處理50～60d，無法滿足直播造林或育苗的供求需要。郭洪英等[5]采用核桃成熟種胚的上胚軸以上部分為試材，接種 40d后長出叢芽原基，而后形成小苗。該研究用核桃楸帶2片子葉的成熟合子胚萌發(fā)成苗僅需 28d，比生產(chǎn)中正常育苗縮短180d左右，且成苗率高，成本下降，技術(shù)簡單而快捷；還可縮短育種周期。

(2)從基本培養(yǎng)基濃度和蔗糖濃度看，核桃楸對(duì)鹽類的需求濃度較高，適宜于核桃楸無菌播種的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。種子萌發(fā)率較高，幼苗生長狀況也較好，可能是培養(yǎng)基鹽離子含量高可以保證組織生長所需的礦質(zhì)元素，滿足種子萌發(fā)和幼苗生長時(shí)對(duì)營養(yǎng)元素的需求。在6-BA濃度為2.5mg/L時(shí)，核桃揪萌發(fā)率最高，這說明核桃楸需要高的細(xì)胞分裂素有利于分化增殖。這與周宇等[6]的研究結(jié)果一致，同時(shí)，在6-BA濃度一定下，附加IBA(0、0.01mg/L)對(duì)核桃楸萌發(fā)效果不顯著。

參考文獻(xiàn)

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[2]陳寶貴.黑龍江省森工林區(qū)核桃楸資源現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J].中國林副特產(chǎn)，2012(3)：67-69.

[3]馬萬里，羅菊春，荊濤，等.珍貴樹種核桃楸的生態(tài)學(xué)問題及培育前景[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)漢文版)，2005，34(4)：489-492.

[4]馮健，陸愛君.我國核桃楸遺傳育種研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(30)：10721-10723.

[5]郭洪英，王永清，李玉堂.核桃離體胚的培養(yǎng)[J].四川林業(yè)科技，1999，20(1)：53-56.

[6]周宇，閆國華，黃武剛.核桃揪的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究[C]//植物組織培養(yǎng)與脫毒快繁技術(shù)：全國植物組培、脫毒快繁及工廠化生產(chǎn)技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.中國學(xué)藝學(xué)會(huì)，2001：137-139.

中圖分類號(hào)S723.1+32.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2015)30-035-02

基金項(xiàng)目黑龍江省森工總局重點(diǎn)應(yīng)用研究項(xiàng)目(sgzjY2012002)；中央財(cái)政林業(yè)科技推廣示范資金項(xiàng)目([2014] HZT03)。

作者簡介張海峰(1975- )，男，上海人，高級(jí)工程師，從事經(jīng)濟(jì)林研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事森林培育研究。

收稿日期2015-09-11

StudyonSterileGerminationConditionsforMatureZygoticEmbryoofJuglans mandshuricaMaxim.

ZHANGHai-feng,ZHANGJian-ying,GEWen-zhi,QIYong-hui*(HeilongjiangAcademyofForestry,Harbin,Heilongjiang150081)

Abstract[Objective] The research aimed to study the suitable methods for Juglans mandshurica Maxim.under sterile conditions and obtain sterile plant germination. [Method] Mature zygotic embryos of Juglans mandshurica Maxim. were experimental material to explore different explants, basic culture medium, hormone, sucrose on the sterile germination. [Result] Zygotic embryos with two cotyledons in MS+BA 2.5 mg/L or MS+BA 2.5 mg/L +IBA 0.01 mg/L effect was the best. [Conclusion] The suitable germination conditions could promote germination of Juglans mandshurica Maxim.and improve germination rate.

Key wordsJuglans mandshurica Maxim.; Sterile germination; Embryo