補腎活血中藥復方對去卵巢大鼠骨密度和骨組織神經肽Y的影響

補腎活血中藥復方對去卵巢大鼠骨密度和骨組織神經肽Y的影響

朱曉峰王廷春1楊麗2王攀攀張榮華2

(暨南大學附屬第一醫院，廣東廣州510630)

摘要〔〕目的探討補腎活血中藥復方對去卵巢大鼠骨密度及血漿和骨組織神經肽Y(NPY)的影響及對防治骨質疏松的作用機制。方法選擇6月齡SD雌性大鼠32只，隨機分為假手術組、模型組、補腎活血中藥復方低劑量組和高劑量組。模型組、復方低劑量組與高劑量組均行雙側去卵巢手術，手術1 w后中藥復方低、高劑量組用灌胃法1.16 g/100 g和10.44 g/100 g給服中藥，模型組灌服生理鹽水，12w后觀察各組大鼠骨密度的改變，采用實時熒光定量(RT-PCR)檢測骨組織NPY mRNA的表達美聯免疫吸附(ELISA)法檢測各組大鼠血漿和骨組織NPY含量，Western印跡檢測骨組織NPY的表達。結果與假手術組比較，模型組骨密度明顯降低(P<0.01)，骨組織中NPY蛋白和mRNA的表達量明顯升高(P<0.01)，血清和骨組織中NPY的含量也明顯升高(P<0.01)。中藥復方低劑量和高劑量組骨密度明顯高于模型組(P<0.01)，血漿和骨組織中NPY 蛋白和mRNA的表達量明顯降低 (P<0.01或0.05)，但仍高于假手術組(P<0.01)。結論補腎活血中藥復方能夠調節血漿和骨組織的NPY，這可能是其抗骨質疏松的作用機理之一。

關鍵詞〔〕補腎活血中藥復方；骨質疏松；神經肽Y

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81173619，81473509)；廣東省自然科學基金(S2012040007531)

通訊作者：張榮華(1964-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事老年病研究。

Effects of Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe on bone mineral density and NPY in plasma and bone tissue in ovariectomized rats

ZHU Xiao-Feng,WANG Ting-Chun,YANG Li,etal.

Traditional Chinese Medicine Department,the First Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou 510630，Guangdong,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe (NKABR) on bone mineral density and the levels of neuropeptide Y (NPY) of plasma and bone tissue in ovariectomized rats. Methods32 SD rats were randomly divided into sham-operated,model,NKABR low-dose and high-dose groups. After ovariectomy 1 w，NKABR groups were given intragastric administration with different doses of NKABR,model group was given normal physiological saline. After 12 w,the changes of bone mineral density was observed,the levels of NPY mRNA or protein in plasma and bone tissue were measured by real-time RT-PCR,ELISA or Western blot. ResultsCompared with that of sham-operated group,BMD of model group was decreased significantly (P<0.01),the levels of NPY mRNA and protein of serum or bone tissue were increased significantly(P<0.01).The bone mineral density of NKABR low dose and high dose group were significantly higher than those of model group(P<0.01),the levels of NPY mRNA and protein of plasma or bone tissue were significantly lower than those of model group (P<0.01 or 0.05),but still higher than those of sham-operated group(P<0.01). ConclusionsNKABR could regulate level of NPY,which might be one of anti-osteoporosis mechanisms.

【Key words】Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe; Bone mineral density; Neuropeptide Y

1天津中醫藥大學中西醫結合博士后流動站

2暨南大學藥學院中藥學教研室

第一作者：朱曉峰(1975-)，男，博士，副主任醫師，主要從事老年病的研究。

研究發現一些神經肽類物質如降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(SP)、神經肽Y(NPY)和血管活性腸肽(VIP)等介導神經骨骼信號在骨代謝中發揮著重要作用，它們通過調節成骨細胞和破骨細胞活性及骨組織微循環參與骨代謝〔1,2〕。研究發現對骨質疏松有明確療效的補腎活血中藥復方(益骨膠囊)可緩解骨痛，調節性激素水平，影響骨組織內的相關神經遞質，并可以調節血漿和骨組織中的CGRP和SP〔3,4〕。NPY在骨代謝和脂質代謝中也起著關鍵作用〔5〕，本研究通過探討補腎活血復方對去卵巢SD骨質疏松大鼠血漿和骨組織中NPY的影響，進一步闡述其調節神經骨骼信號防治骨質疏松的作用機制。

1材料和方法

1.1實驗藥物補腎活血中藥復方(益骨膠囊)藥物由淫羊藿、杜仲、當歸等8味藥組成。灌胃藥物參照既往制備工藝〔6〕。

1.1.1主要試劑戊巴比妥鈉(上海化學試劑廠)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)；NPY ELISA檢測試劑盒(Abnova)；ECL 發光試劑盒(Pierce)；β-tubulin兔抗大鼠Ⅰ抗、NPY兔抗大鼠Ⅰ抗、羊抗兔Ⅱ抗(Santa Cruz)。SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍G250(AMRESCO)；PVDF膜(Axygen)。

1.1.2主要儀器Prodigy型雙能X線骨密度儀(Lunar)；2-16K型高速冷凍離心機(Sigma)；PTC-200型梯度PCR儀、垂直電泳槽、轉移電泳槽、Model680型酶標儀(Bio-Rad)；BT2202s型電子分析天平(Sartorious)。

1.1.3實驗動物6月齡SD雌性大鼠，體重(280±20)g，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物許可證號；SCXK(粵)2008-0002。

1.2實驗方法

1.2.1分組與模型制備將32只6月齡SD雌性大鼠隨機分假手術組、模型組、補腎活血中藥復方低劑量組和高劑量組，每組8只。進行雙側卵巢切除術〔4〕：各組動物均以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠取仰臥位，固定四肢、頭部于動物手術臺上，術區剃毛，消毒，鋪手術孔巾，取大鼠下腹部正中，沿腹白線縱行切口2～3 cm，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離肌肉，打開腹腔，找到雙側卵巢，提起卵巢，用手術線將其周圍相連血管及輸卵管結扎，后切除，切口縫合，消毒，假手術組做同樣切口，找到卵巢后不切除直接縫合，術后均予青霉素10萬單腹腔注射3 d預防感染。

1.2.2給藥方法手術1 w后開始給藥，大鼠灌胃給藥，參考既往研究文獻〔4〕，低劑量按人日用臨床劑量，經人-大鼠體表面積比值折算，1.16 g/100 g給藥，高劑量組予低劑量的6倍(10.44 g/100 g)，空白組予以同等體積的生理鹽水，1次/d。

1.2.3骨密度檢測灌胃12 w后，2%戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，四肢展開平置于Prodigy型雙能X線骨密度儀平臺上檢測骨密度。

1.2.4血漿和骨組織NPY含量的檢測檢測骨密度后進行心臟采血，將心液注入含7.5%乙二胺四乙酸(EDTA)30 μl和抑肽酶40 μl的預冷試管(4℃)內，3000 r/min 4℃離心10 min，取上清注入預冷的試管(4℃)內，存于-80℃冰箱待測。酶聯免疫吸附(ELISA)法測定血漿NPY含量，均按說明書進行。

大鼠處死后置于冰上，迅速取出雙側股骨頭，用濾紙吸干表面液體，將股骨頭用電子天平稱重后，置于盛有液氮的研缽內用手術剪剪碎，移入勻漿器內，每100 mg組織加入1 ml生理鹽水，冷凍勻漿，將勻漿后液體分裝入離心管內，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液置于-80℃的冰箱中保存待測。檢測方法同血漿中NPY的檢測。

1.2.5骨組織NPY mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法，取大鼠股骨頭大鼠處死后取出雙側股骨頭，電子天平稱重后，置于盛有液氮的研缽內用手術剪剪碎，移入勻漿器內，每100 mg組織加入1 ml生理鹽水，冷凍勻漿用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計在UV260/280下測定純度并定量。步驟包括逆轉錄反應；PCR反應；染料法(SYBR Green I)相對定量分析，實驗按照△△Ct解析法設計。擴增條件：95℃預變性10 min，(95℃變性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸15 s)×40個循環。以GAPDH為內參照做平型管，根據GenBank網站中大鼠的NPY的基因序列(NM_012614)和內參GAPDH的基因序列(NM_017008)，采用Primer 5.0軟件設計引物。NPY引物序列：正義：5′-GTG TTT GGG CAT TCT GGC TG-3′，反義：5′- AGT GTC TCA GGG CTG GAT CT-3′，擴增產物長度為159 bp；GAPDH引物序列：正義：5′- ACA TGC CGC CTG GAG AAA CCT -3′，反義：5′- GCC CAG GAT GCC CTT TAG TGG -3′，擴增產物長度為90 bp。反應結束后根據Ct值進行計算和統計。

1.2.6骨組織NPY蛋白表達的檢測勻漿，用Western印跡檢測NPY蛋白的表達。

1.3統計學處理使用SPSS16.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，方差齊同的采用LSD檢驗，方差不齊的采用Tamhane's方法。

2結果

2.1各組大鼠骨密度比較與假手術組〔(0.439±0.032)g/cm2〕比較，模型組大鼠骨密度〔(0.227±0.030)g/cm2〕明顯降低(P<0.01)，補腎活血中藥復方低、高劑量組骨密度〔(0.311±0.016)、(0.395±0.022)g/cm2〕均高于模型組(P<0.01)，但仍低于假手術組(均P<0.01)。

2.2各組大鼠血漿、骨組織NPY含量的變化與假手術組相比，模型組大鼠血漿和骨組織中NPY含量顯著升高(P<0.01)，用藥各組血漿和骨組織中NPY含量均顯著低于模型組，但仍高于假手術組(P<0.01)，見表1。

表1　各組大鼠血漿和骨組織中NPY含量

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

1～4：假手術組、模型組、補腎活血復方低劑量組、補腎活血復方高劑量組 圖1　各組骨組織NPY蛋白的表達

2.3各組大鼠骨組織中NPY mRNA和蛋白相對表達的變化圖1，表2可見，與假手術組相比，模型組大鼠骨組織中NPY mRNA和蛋白的相對表達量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)，用藥各組骨組織中NPY mRNA和蛋白的相對表達量均顯著低于模型組，但仍高于假手術組，差異均具有統計學意義(P<0.01或0.05)。

表2　各組大鼠骨組織NPY mRNA和蛋白相對

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01，3)P<0.05

3討論

近年來，神經信號在調節骨量的作用上不取得突破，其中一個重要的介質是NPY系統，NPY是一個由36個氨基酸組成的多肽，在中樞和周圍神經系統中廣泛表達，通過G蛋白耦聯的受體在骨骼和能量代謝等許多生理過程中起著重要作用，其受體根據克隆的時間先后分別稱為Y1、Y2、Y4、Y5、Y6受體〔7,8〕。研究證實，NPY在骨和脂肪的形成中起著重要作用，側腦室注射NPY后野生型小鼠松質骨體積明顯減少，NPY在下丘腦中過表達可以使成骨細胞活性下降7倍，尤其在皮質骨以及松質骨的表面情況更為明顯；NPY也存在于成骨細胞、骨細胞和破骨細胞中，外周NPY在骨細胞中能通過旁分泌和自分泌起作用；NPY還能抑制骨髓基質細胞向成骨樣細胞分化，研究顯示，NPY可以使顱骨的成骨細胞數量減少，但不能減少NPY1受體敲除小鼠成骨細胞的數量，在對成骨細胞活性的影響上，NPY可以減少成骨細胞骨鈣素和DMP-1基因的表達，減少礦化結節的形成〔9,10〕。NPY與雌激素也有密切的關系，研究發現雌激素可以通過影響NPY的表達從而影響體內能量平衡〔11〕；NPY和雌激素可以共同調節成骨細胞和脂肪細胞的形成，決定骨形成的方向〔12〕。

補腎活血復方由淫養藿、熟地、枸杞、牛膝等藥組成，具有補腎壯骨、活血止痛的功效，方中淫羊藿補腎壯骨為君藥，枸杞子滋陰柔肝補腎為臣藥，當歸養血補血，又能活血止痛，補中有通，行中有補，再配合牛膝既補肝腎又引藥歸經，對因虛而致瘀者可發揮治標之用。研究顯示本方還可以提高骨組織Ⅰ型膠原mRNA和成骨細胞分化因子cbfα-1mRNA在去卵巢骨質疏松大鼠骨組織的表達〔13,14〕，調節神經骨骼信號中的CGRP和SP〔4〕，提高體外培養成骨細胞中骨形態發生蛋白2(bmp-2)和骨保護素(OPG)的表達〔15〕。

本研究說明了NPY升高可能是去卵巢大鼠雌激素降低后骨質疏松的一個發病機制。另外降低NPY的表達可能是其抗骨質疏松的作用機理之一。但是在本項研究中僅探討了NPY在骨組織和血漿中的變化，需進一步研究NPY及其受體在骨質疏松模型中中樞和周圍神經系統及骨組織中的分布與變化，全面闡述NPY在骨質疏松發病中的作用以及與雌激素之間的關系，進一步探討細胞內的分子信號傳導機制及的調節方式，為中醫學“腎主骨生髓，髓通腦”理論提供科學的闡釋。

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〔2014-08-29修回〕

(編輯郭菁)