眼針與體針對腹瀉型腸易激綜合征大鼠下丘腦及結腸組織P物質及神經激肽Ⅰ型受體表達的影響

眼針與體針對腹瀉型腸易激綜合征大鼠下丘腦及結腸組織P物質及神經激肽Ⅰ型受體表達的影響

劉旭東王路王艷杰王哲柴紀嚴王德山

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院，遼寧沈陽110847)

摘要〔〕目的觀察比較眼針及體針對腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)大鼠下丘腦及結腸組織P物質(SP)及神經激肽Ⅰ型受體(NK-1)表達的影響。方法將40只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、眼針組、體針組4組，每組10只。采用慢性應激結合束縛方法建立IBS 大鼠模型。眼針組取下焦區、大腸區、肝區、脾區進行針刺，治療7 d。用免疫組化方法檢測大鼠下丘腦及結腸組織中SP和NK-1蛋白的表達；用RT-PCR方法檢測大鼠下丘腦及結腸組織中SP mRNA的表達。結果與模型組比較，眼針組大鼠下丘腦和結腸組織SP和NK-1蛋白的表達以及SP mRNA的表達均明顯減少(P<0.01)。結論眼針療法優于體針，對D-IBS有治療作用。

關鍵詞〔〕P物質； NK-1受體；眼針；下丘腦

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃973自助項目(2007CB512702)

通訊作者：王德山(1951-)，男，教授，主要從事中醫藥對消化系統神經內分泌功能影響的研究。

第一作者：劉旭東(1980-)，男，講師，碩士，主要從事消化道生理研究。

Effects of eye-acupuncture and acupuncture on expressions of SP and NK-1 receptors in hypothalamus in rats with diarrhea-predominanirritable bowel syndrome

LIU Xu-Dong, WANG Lu, WANG Yan-Jie,etal.

Basic Medicine College, Liaoning University of TCM, Shenyang 110847, Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of the eye-acupuncture therapy on hypothalamus and colonic substance P (SP) and NK-1 receptors contents in rats with diarrhea-predominanirritable bowel syndrome (D-IBS) and explore its related mechanism.MethodsForty male Wistar rats were equally randomized into control, IBS model, eye-acupuncture and acupuncture groups. IBS model was established by giving the rat with chronic stress stimulation (cold-water swimming, tail clamping, electrical shock, etc.) for 18 days. Eye-acupuncture of Xiajiao (Low Energizer) Area, Pi (Spleen) Area, Gan (Liver) Area and Dachang (Large Intestine) Area were given to the rat for 20 min, twice daily for 7 d. The expressions of SP mRNA and NK-1 mRNA were measured by RT-PCR, and the expressions of SP and NK-1 protein were detected by immunohistochemistry. ResultsCompared with the model group, the expressions of SP mRNA,NK-1 mRNA and SP, NK-1 protein in rat hypothalamus and colon after the eye acupuncture therapy were both obviously decreased (P<0.01).ConclusionsEye-acupuncture could reduce hypothalamus and colonic SP and NK-1 contents in D-IBS rats, which might play a role in relieving IBS in eye-acupuncture clinic.

【Key words】SP；NK-1 receptor;Eye acupuncture；Hypothalamus

腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)作為腸易激綜合征的一種亞型，是腹痛或腹部不適伴以腹瀉為主要排便習慣異常的常見胃腸功能紊亂疾病。臨床實踐證明，眼針對胃腸運動功能具有較好的調整作用，在應用眼針防治D-IBS取得良好效果〔1〕。本課題利用D-IBS大鼠模型，觀察眼針及體針療法D-IBS大鼠模型海馬和結腸組織中P物質(SP)和神經激肽Ⅰ型受體(NK-1)含量的影響，探討眼針對IBS 治療的作用機制。

1材料與方法

1.1動物與分組健康SPF級SD大鼠40只，北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2007-0001。雌雄不拘，體質量(280±20)g，適應性喂養1 w，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內溫度22 ℃，相對濕度45%。按隨機數字表法將SD 大鼠分為正常組、模型組、眼針組、體針組4 組，每組10只。

參考文獻1.2IBS 模型的建立除正常組外其余大鼠均采用慢性應激結合束縛方法建立IBS模型。〔2〕的方法并作改進，在18 d中讓大鼠隨機循環接受6種不同的應激刺激，包括：冷水游泳(14℃，5 min)，夾尾(180 s)，禁水(24 h)，禁食(24 h)，電擊(電壓為30 V，電擊5 s，間歇5 s，共進行120 s)，高溫(溫箱中，40℃，30 min)，每天隨機接受1種刺激，18 d內平均每種刺激3次。同時參考文獻〔3〕的方法，每天給予大鼠30%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，用膠帶束縛其前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，束縛1 h 。

1.3取穴及刺法眼針組：造模結束后開始治療。用31號13 mm毫針，于大鼠眼眶周圍2 mm處針刺，定位參照人體眼針取穴方法，取下焦區、大腸區、肝區、脾區。平刺進針3 mm，留針20 min，每12 h治療1次，每日治療2次，共針刺7 d。體針組：體針組左足三里，用31號13 mm毫針平刺進針3 mm，留針20 min，每12 h治療1，每日治療2次，共針刺7 d。

1.4試劑實時定量PCR 試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。SP及NK-1引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠SP及NK-1多克隆抗體、DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。SP引物序列：上游：5′-ATGAAAATCCTCGTGGCGGT-3′，下游：5′-CAGCATCCCGTTTGCCCATT-3′；NK-1引物序列：上游：5′-ATGCCCAGCAGAGTCGTGTG-3′，下游：5′-CAGTGTACGCGTAGCCGATCA-3′。

1.5指標測定及方法采用RT-PCR方法檢測大鼠結腸及下丘腦SP mRNA表達，免疫組化檢測大鼠結腸、下丘腦SP、NK-1蛋白表達。

1.6統計學方法采用SPSS10.0軟件進行統計學分析，組間比較行方差分析。

2結果

2.1各組大鼠結腸組織SP及NK-1表達水平比較與正常組SP mRNA(0.15±0.06)和蛋白(0.171±0.022)比較，模型組結腸SP mRNA及蛋白表達水平顯著升高(0.66±0.21，0.262±0.019，P<0.01)；和模型組比較，眼針組SP mRNA及蛋白(0.34±0.10,0.214±0.023)、體針組結腸SP mRNA及蛋白(0.22±0.09、0.231±0.017)表達水平顯著降低(P<0.01)。與正常組NK1蛋白(0.215±0.014)比較，模型組大鼠結腸NK-1蛋白(0.246±0.015)表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，眼針組(0.223±0.015)和體針組大鼠結腸NK-1蛋白(0.230±0.015)的表達水平顯著降低(P<0.01)；與眼針組相比，體針組無顯著差異(P>0.05)。見圖1～圖3。

2.2各組大鼠下丘腦SP和NK-1 mRNA及蛋白表達水平的比較和正常組SP mRNA及蛋白表達(0.17±0.02、0.181±0.020)比較，模型組大鼠下丘腦SP mRNA及蛋白表達水平顯著升高(0.48±0.05、0.234±0.009，P<0.01)；和模型組比較，眼針組大鼠下丘腦SP mRNA及蛋白表達水平顯著降低(0.37±0.07、0.216±0.010,P<0.01)，體針組SP mRNA及蛋白表達水平顯著降低(0.41±0.04、0.209±0.009,P<0.05)；和眼針組比較，體針組SP mRNA及蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)。見圖4，圖5。

與正常組相比，模型組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達水平升高(0.228±0.007 vs 0.201±0.007，P<0.01)，與模型組相比，眼針組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達水平降低(0.215±0.006,P<0.01)，體針組無顯著差異(0.224±0.010,P>0.05)；與眼針組相比體針組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖6。

M為Marker，1～3泳道為正常組，4～6泳道為模型組，7～9泳道為眼針組，10～12泳道為體針組 圖1　各組大鼠結腸組織SP mRNA表達

圖2　各組大鼠結腸SP蛋白表達(DAB，×400)

圖3　各組大鼠結腸NK-1蛋白表達(DAB,×400)

M為Marker，1～3泳道為正常組，4～6泳道為模型組，7～9泳道為眼針組，10～12泳道為體針組 圖4　各組大鼠下丘腦SP mRNA表達

圖5　各組大鼠下丘腦 SP蛋白表達(DAB，×400)

圖6　各組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達(DAB，×400)

3討論

眼針療法是根據眼球結膜上血管的形色變化，判斷疾病的性質與部位，然后辨證針刺眼周穴，以治療全身疾病的一種方法〔4〕。眼針的理論基礎源于“十二經脈三百六十五絡，其血氣皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為睛”，即眼周八區十三穴與周身十二經脈有密切聯系，針刺眼周十三穴可以調整十二經脈的功能，從而取得療效〔5〕。IBS 是一組以腹痛或腹部不適，同時伴有排便習慣改變和(或) 大便性狀異常為主要癥狀的腸道功能性疾病。近年來發現，中樞神經系統和腸神經叢功能失調，導致腦腸軸功能異常，可能是IBS 患者對各種應激反應增強和內臟敏感性增加的主要原因。腦腸肽在調節腦腸軸功能方面起著重要的作用，具有激素和神經遞質的雙重性。SP 是目前研究較多的腦腸肽，在胃腸道功能調節中具有重要作用，有研究表明SP通過激活NK-1受體和NK-2受體，刺激直腸黏膜的離子交換與IBS的發生相關。最近已發現多種速激肽受體(P物質受體)拮抗劑，如TAK-637對IBS具有治療作用〔6〕。SP能纖維主要分布在腸壁肌層〔7〕。SP作為興奮性神經遞質，在消化道的運動和分泌中起著重要作用，能夠加速胃腸蠕動，促進胃腸道平滑肌收縮和胃腸道運動，加強結腸的集團推進運動，使患者排便次數增多。SP在IBS的應激、腸道感染、內臟敏感性增高及與之相關的神經-免疫-內分泌調控機制中均有重要作用〔8，9〕。本文結果表明，眼針療法能夠降低IBS 模型大鼠結腸組織及下丘腦NK-1和SP的表達，改善了IBS發病過程中腦腸軸功能的異常，對IBS起到了治療作用，但體針組SP表達降低沒有眼針效果明顯，說明眼針刺激外周相關穴位，通過外周感受器與大腦皮層“點”對“點”的聯系，其傳出信息反射性啟動靶器官神經遞質、細胞因子等釋放和分泌，從而調控局部血運與代謝，改善其功能，達到治療效果。

4參考文獻

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〔2014-07-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)