CXCR2-siRNA重組質粒治療宮頸癌的動物實驗

CXCR2-siRNA重組質粒治療宮頸癌的動物實驗

楊澤宇王鋼1許曉茵2

(中國醫科大學附屬盛京醫院超聲科，遼寧沈陽110004)

摘要〔〕目的研究趨化因子受體CXCR2的siRNA質粒構建及對裸鼠移植宮頸癌的抑制作用。方法將通過人源CXCR2的基因序列設計的siRNA和質粒pDC316-EGFP-U6通過內切酶鏈接，同時引入膽固醇修飾，將重組質粒免疫建立好的裸鼠模式動物，通過測算評價重組質粒的治療效果。結果瓊脂糖凝膠電泳發現重組質粒大小正確，濃度合適；經過28 d的治療，空白對照組和空質粒對照組腫瘤體積生長比較無差異(P>0．05)；重組質粒治療組的效果明顯，與前兩組比較差異顯著(P<0．01)，并且重組質粒治療組的抑瘤率達到50%；熒光顯微鏡觀察增強綠色熒光信號，產生熒光的細胞約占總細胞的8%，體內轉染效果明顯。結論經過本實驗設計和構建的重組質粒對趨化因子受體的表達具有抑制作用，在裸鼠模式動物治療效果中具有重要意義。

關鍵詞〔〕siRNA；CXCR2；宮頸癌；裸鼠移植腫瘤

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

1中國醫科大學附屬盛京醫院急診科

2溫州醫科大學附屬第二醫院外科

第一作者：楊澤宇(1977-)，女，博士，主治醫師，主要從事婦產科疾病診斷、產前篩查相關的分子生物學基礎研究。

CXCR2屬于G蛋白相關受體超家族，與趨化因子超家族CXC亞家族成員白細胞介素(IL)-8具有高度特異性和親和力。近年來研究表明趨化因子受體在腫瘤的發展過程中起重要作用，腫瘤細胞表面受體中CXCR2與腫瘤發生、發展密切相關〔1，2〕。RNA干擾(RNAi)是在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現象，能特異、高效地沉默靶標基因。siRNA可經由多種不同轉染技術導入細胞內，并對特定基因產生具有專一性的抑制表達效果〔3～5〕。目前，RNAi已經成為研究基因功能的有效方法，并且RNAi技術具有高效性和特異性，極有可能發展成為特異性治療腫瘤的手段。

1材料與方法

1.1siRNA序列和載體的構建根據GenBank中人源CXCR2基因序列，使用軟件siRNA Target Finder設計siRNA序列，該軟件由Ambion公司提供。CXCR2-siRNA序列為：正義5′GAACAAAUUUACAGAGACAUU3′；反義3′UUCUUGUUUAAAUGUCUCUGU(5′-P)5′；同時在其序列中引入內切酶位點：正向5′-AAGCTT-3′；反向5′-GGATCC-3′。siRNA由上海生工生物科技有限公司合成。

載體的選擇：使用腺病毒載體siRNA穿梭質粒：pDC316-EGFP-U6，購自于北京本元正陽基因技術有限公司，其啟動子是人U6啟動子，同時表達EGFP。使用內切酶位點BamH Ⅰ(位于2017) 和Hind Ⅲ(位于：1997)進行基因的鏈接。

鏈接反應：反應體系為CXCR2-siRNA 2 μl(約200 ng)；Vector DN(pDC316-EGFP-U6) 1 μl(約50 ng)；H2O 2 μl；Ligation Solution1 5 μl。反應條件為：16℃，10h。鏈接反應使用TaKaRa公司鏈接試劑盒完成。

1.2質粒轉化大腸桿菌將連接好的重組質粒液10 μl全量轉化至E.coli JM109 Competent Cell(TaKaRa Code No.D9052)，轉化過程按照說明書進行。轉化后涂在含氨芐抗性的LB培養板，4℃培養16 h，挑選氨芐抗性陽性單菌落。提取陽性菌落的質粒，通過測序確定篩選到的質粒為插入CXCR2-siRNA的重組質粒，命名為：pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA。按菌液∶甘油(高壓滅菌)1∶1的比例將菌種凍存于-80℃備用。

1.3重組質粒pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA的大量制備將含重組質粒pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA的菌株接種于500 ml LB氨芐培養基中培養菌株，18 h后進行質粒的大規模提取，使用質粒提取試劑盒Qiagen?？召|粒pDC316-EGFP-U6的大量制備按照相同的方法進行。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒。

1.4重組質粒的膽固醇修飾脂質體購自于上海艾韋特醫藥科技有限公司。用吡咯烷做連接劑，在重組質粒的SV40 ployA位點連接上膽固醇得到chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA。質粒結構圖見圖1。

圖1　重組質粒基因插入結構圖

1.5裸鼠動物模型的建立5～6周齡健康免疫缺陷BALB/c裸鼠18只，雌雄各半，SPF級，體重(12±2)g，購自北京生物梅里埃公司。喂養于嚴格消毒的無菌層流動物房內，環境溫度維持在25℃，空氣濕度維持在50%～70%，飼料和水經消毒處理后自由進食。

人宮頸癌Hela細胞復蘇后，在37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中用含10%小牛血清的RPMI1640培養液常規培養，胰蛋白酶消化細胞并計數。取對數生長期的宮頸癌Hela細胞制成單細胞懸液，調節細胞濃度為1.8×107/ml，于每只裸鼠右前肢腋下皮下接種0.3 ml細胞懸液，接種后每天觀察注射點成瘤情況，以皮下結節體積達50 mm為成瘤標準。

1.6動物實驗18只裸鼠移植瘤在接種后第14天均達到成瘤標準，成瘤率為100%，稱重隨機分為空白對照組、空質粒對照組、重組質粒治療組，每組6只。詳細記錄瘤體體積及裸鼠體重變化，測量及體積計算方法〔6，7〕：在成瘤后第1、5、9、13、17、21、25天用游標卡尺測量瘤體長短徑(a、b)；腫瘤體積V(mm3)=a×b2/2；抑瘤率(%)=(1-治療組V/對照組V)×100%。

裸鼠成瘤后第1、4、7、10、13、16、19、21天進行多點瘤內原位注射，使用分光光度計測定重癥質粒的OD260值，按照1 OD=50 μg/ml換算，每只小鼠注射chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA量為0.10 mg。

治療結束后第2天數據采集后處死裸鼠，部分腫瘤組織用10%甲醛固定，部分腫瘤組織儲存在液氮中備用。

2結果

2.1重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳檢測將試劑盒大規模提取的質粒通過3%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，發現其大小正確，濃度合適。見圖2。

圖2　3%瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒

2.2裸鼠人宮頸癌移植瘤的生長抑制各實驗組均于接種細胞6 d后可觸及瘤體結節，2 w后均達到實驗需要的成瘤標準，成瘤率為100%。經過28 d的治療，空白對照組和空質粒對照組腫瘤體積〔(1 529.51±23.44)mm3vs (1 499.83±36.58)mm3〕比較無差異(P>0．05)；14 d時重組質粒治療組〔(836.27±53.19)mm3〕與前兩組比較差異顯著(P<0.01)。28 d時，重組質粒治療組抑瘤率(50%)與其他各組(均0%)比較差異顯著(P<0.01)。

2.3光鏡觀察結果取部分腫瘤組織做常規病理切片，經重組質粒治療后的腫瘤組織切片見癌細胞出現細胞核固縮、凋亡細胞形成；而空白對照組和空質粒對照組的腫瘤組織切片可見癌細胞生長良好，核分裂相多見。重組質粒治療組荷瘤裸鼠的肺、肝臟、腎臟組織病理切片顯示正常表現，未發現轉移灶。

2.4移植瘤組織中EGFP熒光信號的檢測經過重組質粒治療后，將裸鼠腫瘤組織用10%甲醛固定，熒光電鏡下觀察增強綠色熒光蛋白EGFP熒光信號。觀察發現腫瘤組織出現綠色熒光，產生熒光的細胞約占總細胞的8%，說明重組質粒成功轉染到周圍腫瘤組織，穩定表達外源的EGFP。見圖3。

圖3　熒光顯微鏡觀察重組質粒治療組腫瘤組織中 EGFP熒光信號

3討論

宮頸癌是女性第二大常見的惡性腫瘤，早期可發生淋巴轉移，且近年發現有年輕化趨勢。宮頸癌治療早期以手術為主、輔以放化療，晚期放療為主、輔以化療，但仍然需要補充新療法，其中基因治療被認為是最有前途和挑戰性的研究方向之一，而目前基因治療的研究熱點是RNAi技術。siRNA分子是RNAi過程中的中間產物，通常是一段長20～25個核苷酸的雙鏈RNA，雙鏈分別在RNA 3′端超出另一端兩個核苷酸，這種結構是DICER酶處理而來。siRNA可經由多種不同轉染技術導入細胞內，并對特定基因產生具有專一性的抑制表達效果。經過實驗證實這種設計是可行有效的〔5～9〕。

在穿梭質粒載體上的選擇上，本研究選擇腺病毒載體siRNA穿梭質粒pDC316-EGFP-U6。該質粒以pDC316質粒為骨架改造，啟動子是人U6啟動子，為在人類宮頸癌基因治療中的應用提供前提準備。同時表達EGFP，便于示蹤和估計轉導效率。另外，該質粒包括多種抗性基因，便于平板篩選陽性克隆。包括SV40ployA，有利于后續加工和修改。

EGFP是熒光分子，它的熒光強度是綠色熒光蛋白(GFP)的35倍，通過熒光顯微鏡能夠觀察重組質粒的傳染效率。在細胞質中有104個或細胞表面有2×103個EGFP分子時，即可被流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到。因此，另可以直接用于檢測活細胞內的基因表達。

基因的靶向治療中，由于組織或血液中存有大量的核酸酶，會直接導致RNA藥物分子的迅速降解，使得RNAi機制喪失或藥效丟失。所以如何有效解決裸RNA藥物分子在血液中的穩定性十分關鍵〔6～10〕。 一般的解決方案包括：化學修飾RNA分子二甲基化修飾或膽固醇修飾等；利用功能高分子或脂質體載體包裹裸RNA藥物分子。本研究中一是選擇膽固醇修飾，用吡咯烷做連接劑，在重組質粒的SV40 ployA位點連接上膽固醇得到chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA；另外，使用聚乙烯吡咯烷酮(分子量6 000的PVP)修飾脂質體。聚乙烯吡咯烷酮作為一種兩親性聚合物，具有良好的生物相容性，可用作脂質體立體保護劑。這樣不僅解決了RNA藥物分子在組織中的穩定性，也可以解決RNA藥物分子在全身傳輸中的組織器官靶向性難題，使其能夠到達指定腫瘤組織中發揮抑制作用。本研究為siRNA基因靶向治療宮頸癌提供了研究基礎。

4參考文獻

1王淑強，李鵬，郭穎，等.趨化因子受體在子宮頸癌中的表達及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2010；15：2105-6.

2何英，唐利立.siRNA真核表達載體的構建及其對CXCR4基因的沉默效應〔J〕.中國普通外科雜志，2006；15(10)：736-40.

3黃國民，林瑞新，房學東，等.利用siRNA抑制環氧合酶-2對人胃癌裸鼠移植瘤的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010；2：210-2.

4李金東，孫梅，高楠，等.siRNA-Med19對人肺癌A549細胞Med19轉錄、表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009；9：1072-4.

5于振香，華樹成，于水.survivin-siRNA對肺癌細胞A549增殖抑制的影響〔J〕.中國老年學雜志,2008；28(11)：1057-9.

6陳麗，杜永亮，賈曉民，等.靶向IGF1R基因的shRNA對人肺腺癌細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用〔J〕.山西醫科大學學報，2013；44(9)：684-7.

7張莉，唐潔，尹愈佳，等.基于膽固醇上不同連接方式修飾的穿膜肽脂質體的對比研究〔J〕.華西藥學雜志，2012；27(5)：490-3.

8魏瑋，姜玉華，王艷琴，等.Bcl-2與c-mycASODN聯合轉染對裸鼠宮頸癌Hela細胞皮下移植瘤抑制作用研究〔J〕.醫學信息，2012；25(8)：70-1.

9王茂楠，夏昕，徐松柏，等.siRNA抑制PTTG表達對人結腸癌LoVo細胞生物學活性的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；13：3114-6.

10汪洋，王家林.趨化因子配體及其抗體對骨癌痛患者脊髓膠質細胞活化的影響及與骨癌痛的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2013；2：421-2.

〔2014-09-15修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)