蟲草多糖對哮喘模型大鼠血清白細胞介素-17和IgE水平動態變化的影響

蟲草多糖對哮喘模型大鼠血清白細胞介素-17和IgE水平動態變化的影響

吳海弟劉禮榮陳永倖

(海南省人民醫院呼吸內科，海南海口570311)

摘要〔〕目的研究蟲草多糖對哮喘模型大鼠血清白細胞介素(IL)-17和IgE水平動態變化的影響。方法選取SPF級雄性SD大鼠80只，隨機分為兩組，其中實驗組60只，給予50 μg卵清蛋白(OVA)+150 μl氫氧化鋁干粉+50 μl生理鹽水腹腔注射，建立支氣管哮喘大鼠模型，正常對照組20只，予等量生理鹽水灌胃；造模成功過后，將實驗組隨機分為模型組30只和蟲草組30只。蟲草組大鼠予150 mg/kg蟲草多糖每日一次灌胃，連續14 d；模型組大鼠給予等量的生理鹽水每日一次灌胃，連續14 d。實驗結束后，對比實驗前后各組大鼠血清IL-17和IgE水平、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞比例、嗜酸性粒細胞比例及總細胞數。結果①實驗組大鼠的血清IL-17含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IL-17含量與模型組(13.01±1.65)比較明顯較低(P<0.05)；②實驗組大鼠血清IgE含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IgE含量與模型組比較明顯較低(P<0.05)。③實驗組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞比例以及嗜酸性粒細胞比例均明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞比例以及嗜酸性粒細胞比例明顯低于模型組(P<0.05)。④大鼠血清IL-17與IgE水平存在明顯的正相關關系(r=0.963，P<0.01)。結論蟲草多糖能夠明顯降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，減輕炎癥反應。

關鍵詞〔〕蟲草多糖；哮喘；白細胞介素-17；IgE

中圖分類號〔〕R562.2+5〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：吳海弟(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事呼吸系統疾病基礎與臨床研究。

支氣管哮喘是由中性粒細胞、肥大細胞、T嗜酸性粒細胞、嗜酸性粒細胞等多種免疫細胞參與而引起的一種氣道慢性炎癥性疾病〔1〕。本病臨床表現為氣道高反應而引起的氣喘、胸悶、咳嗽、呼吸困難等癥狀，嚴重者可出現低氧血癥，甚至危及生命〔2〕。中醫屬“哮病”的范疇。隨著分子生物學技術的發展，本病人們更加重視疾病防治及預后，現代醫學多采取擴張支氣管、激素類藥物抗炎等對癥療法〔3〕，但只能暫時控制病情發展，而且激素類藥物存在免疫力下降、體態改變、骨質疏松等副作用，治療效果并不理想，亟需尋找治療哮喘的新思路。研究發現，哮喘屬于變態反應性疾病，發生過程中有大量的免疫細胞參與，與機體免疫功能的改變密切相關〔4〕，蟲草多糖能夠止咳、化痰、改善呼吸系統，能夠提高人體免疫力〔5〕，但關于其治療哮喘的實驗研究較少，為了增強療效，緩解痛苦，改善哮喘患者預后。本文觀察蟲草多糖對急性哮喘模型大鼠血清白細胞介素(IL)-17和IgE水平。

1對象與方法

1.1實驗動物與分組選取成年的SPF級雄性SD大鼠80只(由遼寧中醫藥大學動物實驗室提供)，體重(280±20)g。將大鼠隨機分為2組，實驗組60只，正常對照組20只。給予安靜、溫暖、光照適合、通風良好的飼養環境，保持室內溫度20℃左右，濕度設定在40%～60%，投喂標準飼料，讓其自由進食，調節光照，晝夜節律正常。

1.2主要試劑和儀器卵清蛋白(OVA，北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鋁干粉(沈陽化工廠)；蟲草多糖(含量90%，由云南省微生物所提供)；大鼠IL-17抗體試劑盒和大鼠IgE抗體試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；PBS漂洗緩沖液(BOSTER公司)；離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；DW-86W100超低溫冰箱(青島海爾)；SpectraMax M5酶標儀(美國Molecular Devices)；光學顯微鏡(美國應用生物系統公司)。

1.3造模方法兩組大鼠均正常適應性飼養5 d，之后于第0天、第7天、第14天，分別給予實驗組大鼠腹腔注射致敏劑(50 μg OVA+150 μl氫氧化鋁干粉+50 μl生理鹽水，制成混懸液)，正常對照組給予等量生理鹽水腹腔注射；第7天，給予實驗組大鼠皮下注射10 g/L OVA溶液，以增強過敏反應，正常對照組給予等量生理鹽水腹腔注射；第14天開始每日一次霧化吸入OVA溶液(10 g/L)，每次持續30 min，連續4 d；正常對照組予霧化吸入等量生理鹽水。實驗組大鼠出現呼吸急促、噴嚏、不安、口唇發紺、毛發干枯等表現即為造模成功，實驗組大鼠全部造模成功。

1.4實驗方法及標本采集造模成功后，將模型組大鼠隨機分為模型組30只和蟲草組30只。蟲草組大鼠予150 mg/kg蟲草多糖每日一次灌胃，連續14 d；模型組大鼠給予等量的生理鹽水每日一次灌胃，連續14 d；各組小鼠均正常飼養。造模前后及治療后，分別從各組大鼠的眼眶抽取靜脈血3 ml，利用離心機3 000 r/min離心，取上清液，分成兩部分，分別置于4℃和-80℃冰箱中保存備用。靜脈血采集完成后，處死大鼠，迅速阻斷左側支氣管，采用PBS液對右側支氣管進行灌洗，反復3次，抽吸收集灌洗液備用。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清IL-17、IgE含量取出-80℃保存的血清測定IL-17含量，嚴格按照ELISA試劑盒的說明書操作，將血清和試劑在室溫下放置30 min→將50 μl樣本、標準品滴加到酶標板上→90 min后，孔內滴加大鼠IL-17抗體工作液0.1 ml→置入37℃保溫箱中1 h→采用PBS進行洗滌，反復3次后→滴加酶標工作液(0.1 ml/孔)→置入37℃保溫箱中1 h→ 200 μlPBS液洗滌，反復5次→滴加50 μl顯色液TMB→培育30 min，至標準品藍染→滴加TMB終止液0.1 ml，可見藍色變為黃色→利用450 nm酶標儀測定光密度(OD)值→計算樣品IL-17含量。取出4℃保存的血清按照以上步驟測定血清IgE含量。

1.5.2肺泡灌洗液中總細胞數目、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞比例測定取出收集的肺泡灌洗液，利用離心機3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉渣中加入PBS液制成懸濁液，涂于載玻片上，95%乙醇固定后進行HE染色，于光鏡下觀察總細胞數目，并計算中性粒細胞比例以及嗜酸性粒細胞比例。

1.6統計學方法采用SPSS19.0進行t檢驗及χ2檢驗；相關性采用線性相關分析。

2結果

2.1治療前后各組大鼠血清IL-17水平比較實驗組大鼠的血清IL-17含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠的血清IL-17含量，與模型組(13.01±1.65)比較明顯較低(P<0.05)，見表1。

表1　治療前后各組大鼠血清IL-17、IgE水平及肺泡灌洗液細胞數比較( ± s)

與正常對照組比較:1)P<0.05；與模型組治療后比較:2)P<0.05

2.2治療前后各組大鼠血清IgE水平比較實驗組大鼠血清IgE含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IgE含量與模型組比較明顯較低(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞比例及嗜酸性粒細胞比例比較實驗組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞比例及嗜酸性粒細胞比例均明顯高于正常對照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠肺泡灌洗液細胞總數、中性粒細胞比例以及嗜酸性粒細胞比例明顯低于模型組(P<0.05)，見表1。

2.4哮喘大鼠血清IL-17與IgE水平的相關性哮喘大鼠血清IL-17與IgE水平呈正相關(r=0.963，P<0.01)，見圖1。

圖1　哮喘血清IL-17與IgE水平相關性

3討論

支氣管哮喘與遺傳、過敏源、環境污染等多種因素有關〔6〕，是由多種炎性細胞及細胞因子參與的氣道高反應性疾病。近年來，隨著環境及生活方式的改變，支氣管哮喘的發病率不斷增加，以其發病急、臨床表現重、易反復等特點〔7〕，嚴重影響人們的生命健康和生活質量，而目前的激素類藥物對癥治療副作用較大，臨床效果并不理想。有研究發現〔8〕，哮喘模型大鼠體內存在Th1/Th2細胞的失衡，Th17細胞增多，同時各種相關細胞因子含量也升高，免疫功能異常，為支氣管哮喘的治療提供了新思路。蟲草多糖提取自古老的中藥冬蟲夏草，中醫認為，冬蟲夏草性溫，味甘，具有補虛損、益精氣、止咳化痰之功〔9〕，現代臨床研究亦證實，蟲草多糖在治療呼吸系統疾病、提高免疫力方面具有良好的臨床療效〔10〕。

本研究顯示，哮喘大鼠血清IL-17、IgE含量明顯高于正常大鼠；治療后，蟲草組大鼠的血清IL-17、IgE含量與模型大鼠比較明顯較低。IL-17是一種多功能的細胞因子〔11〕，能夠促進中性粒細胞發育，放大氣道的炎癥反應，促進哮喘發作；IgE可以促使嗜酸性粒細胞增多〔12〕，加重哮喘發作。IL-17和IgE起到相輔相成的作用，這與本研究結果相同。本研究結果提示蟲草多糖可以通過降低IL-17、IgE水平，從而降低哮喘反應程度，蟲草多糖能夠使中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞的含量降低，減輕炎癥反應，這可能與其降低IL-17、IgE水平有關。

總之，蟲草多糖能夠明顯降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，減輕炎癥反應，對臨床具有指導意義，值得臨床推廣。

4參考文獻

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〔2013-12-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)