miR-196a對非小細胞肺癌A549增殖及上皮間質轉化的影響

miR-196a對非小細胞肺癌A549增殖及上皮間質轉化的影響

蘇鵬飛李穎璐1段東奎

(南陽市中心醫院，河南南陽473000)

摘要〔〕目的探討microRNA-196a(miR-196a)對非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞增殖及上皮間質轉化(EMT)的影響。方法通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測人NSCLC細胞系A549與正常支氣管上皮細胞系HBE中miR-196a的表達水平。根據實驗將A549細胞分為對照組、空轉染組、miR-196a抑制(轉染inhibitor)組和miR-196a過表達(轉染mimics)組。采用qRT-PCR檢測轉染24、48、72、96 h各組的轉染效果，四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測各組轉染24、48、72、96 h的增殖能力，Western印跡法檢測各組轉染48 h后的上皮表型標志物〔角蛋白(CK)18和鈣黏蛋白(E-cadherin)〕和間充質表型標志物〔α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白(FN)〕的蛋白水平，采用流式細胞儀和酶聯免疫吸附法(ELISA)測量各組轉染24、48、72、96 h的A549細胞α-SMA陽性率和細胞上清液中FN水平。結果A549細胞的miR-196a水平高于HBE細胞(P<0.05)，且轉染miR-196a inhibitor或mimics可呈時間依賴的方式降低或升高A549細胞的miR-196a水平(P<0.05)；與對照組相比，miR-196a抑制組轉染24、48、72、96 h的增殖率及α-SMA陽性率和上清液FN水平均降低，轉染48 h的CK18和E-cadherin的蛋白水平升高，α-SMA和FN的蛋白水平降低；而miR-196a過表達組以上指標的變化趨勢與miR-196a抑制組相反，與其余3組均有統計學差異(P<0.05)。結論A549細胞中miR-196a呈高表達，抑制miR-196a表達可抑制A549細胞增殖和EMT，而升高miR-196a表達可促進A549細胞增殖和EMT。

關鍵詞〔〕microRNA-196a；非小細胞肺癌；細胞增殖；上皮間質轉化

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

1南陽醫學高等?？茖W校第一附屬醫院腫瘤內科二病區

第一作者：蘇鵬飛(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事胸外科研究。

非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%以上，5年生存率僅約為11%〔1〕。研究〔2〕發現肺癌的發生發展及惡性轉化不僅受到遺傳因素影響，而且還受表觀遺傳學影響，其中小分子非編碼RNA中的miRNA發揮了重要作用。miRNA在生物體內廣泛存在，可通過調控靶基因表達來影響腫瘤的發生發展。新近研究發現microRNA-196a(miR-196a)在胃癌中發揮了癌基因的作用〔3〕。筆者推測miR-196a在肺癌中亦發揮重要作用，本研究在檢測肺癌細胞系A549的基礎上，探討改變其水平對A549細胞增殖及上皮間質轉化(EMT)的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器NSCLC細胞系A549及正常支氣管上皮細胞系HBE購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，胎牛血清及RPMI 1640培養基均購自美國GIBCO公司，LipofectamineTM 2000、TRIzol購自美國Invitrogen公司，miR-196a inhibitor、miR-196a mimics購自美國Applied Biosystems公司，實時定量PCR試劑盒、FastStart DNA Master SYBR Green I購自瑞士Roche公司，MTT、PVDF膜購自美國sigma公司，角蛋白(CK)18、鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及纖連蛋白(FN)一抗均購自美國Cell Sigaling Technology公司。主要儀器：細胞培養箱購自美國Thermo公司，Prism 7000型定量PCR儀購自美國ABI公司，FACScan流式細胞儀購自美國BD公司，電泳儀和轉膜儀購自美國 Bio Rad公司，Elx800型自動酶標儀購自美國 BioTek公司。

1.2細胞培養和轉染用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養A549細胞，置于37℃，5% CO2飽和濕度培養箱中培養。每隔2～3 d換液，待其達70%～80%融合度時，可進行后續轉染實驗。

1.3實時定量PCR(qRT-PCR)檢測參照說明書進行qPCR檢測A549細胞和HBE細胞中的miR-196a水平。由上海生工生物工程有限公司設計并合成miR-196a及內參U6的引物。miR-196a逆轉錄引物：5′-CAGAAGGAATGATGCACAGCCAACAACA-3′；正義：5′-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3′,反義：5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′;U6逆轉錄引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。總轉錄體系為20 μl：RNA模板2.0 μl、上下游引物各0.8 μl、ROX Reference Dye(50×)0.5 μl、SYBR熒光染料試劑10.0 μl，ddH2O補齊。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。采用Ct值法(2-△△CT)法表示miR-196a的相對表達量。

1.4分組及轉染取對數期細胞進行實驗并根據實驗設計分為對照組、空轉染組、miR-196a抑制組和miR-196a過表達組。對照組不作任何處理，而空轉染組、miR-196a抑制組和miR-196a過表達組按照Lipofectamine 2000說明書分別轉染空載體、miR-196a inhibitor或miR-196a mimics。分別于轉染24、48、72及96 h后采用qRT-PCR檢測各組的miR-196a水平來評價轉染效果(方法同1.3)。

1.5四甲基偶氮唑藍比色法(MTT) 采用MTT法檢測改變miR-196a水平對A549細胞增殖的影響。將對數生長期細胞以1×105個接種于96孔板中，分別于轉染24、48、72、96 h后，加入5 μg/μl預先配好的MTT溶液20 μl，孵育4 h后加入DMSO(150 μl/孔)，在490 nm波長下檢測各組的吸光值(A)。以對照組為參考，計算其余各組A值與對照組的比值以此計為增殖率。實驗重復3次。

1.6Western印跡收集轉染48 h后的各組細胞，冰上充分裂解，高速離心后保留上清液，檢測其蛋白濃度。每孔取等量蛋白，與上樣緩沖液混勻后進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將目的蛋白半干轉至PVDF膜，加入適量的CK18、E-cadherin、α-SMA及FN一抗(除CK18為1∶200外，其余為1∶100)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶5 000)，化學發光法來顯影后，采用Gel-Pro analyzer軟件分析各條帶的光密度，結果表示為各目的蛋白與內參β-actin的比值。

1.7α-SMA陽性率及上清液中FN水平檢測收集轉染48 h后各組細胞及培養上清液，分別采用流式細胞術及酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測α-SMA陽性率及FN水平，實驗操作完全依據試劑盒說明書完成。

1.8統計學處理采用SPSS16.0軟件進行數據分析。組間比較采用方差分析和Bonfferoni檢驗。

2結果

2.1肺癌細胞系中miR-196a表達水平A549細胞的miR-196a水平(15.39±2.74)高于HBE細胞(P<0.05)；miR-196a抑制組轉染24、48、72、96 h的miR-196a水平均低于對照組(P<0.05)，而miR-196a過表達組均高于其余3組(P<0.05)(P<0.05)；且空轉染組與對照組miR-196a的差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.2miR-196a水平變化對A549細胞增殖率的影響與對照組相比，miR-196a抑制組轉染24、48、72及96 h的增殖率均降低，且miR-196a過表達組均升高(P<0.05)；空轉染組與對照組以上觀察點增殖率的差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

與對照組比較：1)P<0.05；與空轉染組比較：2)P<0.05；與miR-196a抑制組比較：3)P<0.05；下圖、下表同 圖1　肺癌細胞系中miR-196a轉染情況

圖2　miR-196a水平變化對A549細胞增殖率的影響

2.3miR-196a水平變化對EMT標志物蛋白水平的影響與對照組相比，miR-196a抑制組CK18和E-cadherin的蛋白水平升高，α-SMA和FN的蛋白水平降低，而miR-196a過表達組CK18和E-cadherin的蛋白水平降低，α-SMA和FN的蛋白水平升高(均P<0.05)；空轉染組與對照組以上指標的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　miR-196a水平變化對EMT標志物蛋白水平影響

2.4miR-196a水平變化對α-SMA陽性細胞百分率的影響與對照組相比，miR-196a抑制組轉染24、48、72及96 h的α-SMA陽性率、FN水平均降低，而miR-196a過表達組均升高(P<0.05)；空轉染組與對照組以上觀察點α-SMA陽性率及FN水平的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2　miR-196a水平變化對α-SMA陽性率及FN水平的影響

3討論

MicroRNA是一類單鏈非編碼小RNA分子，在進化上較為保守，通過與靶基因mRNA特異性結合，繼而影響靶蛋白表達水平，發揮影響該蛋白參與信號通路的作用，故在腫瘤的發生發展中有重要作用〔4～6〕。由于癌組織和癌旁組織的miRNA譜存在差異，且某些miRNA表達在腫瘤中具有特異性，因此也被建議用于腫瘤的診斷、治療方案制訂及預后評價。研究發現miR-196a與腫瘤的發生發展有關，如尹凌帝等〔3〕發現miR-196a可通過HOXA5來調控胃癌細胞MGC-803的侵襲轉移。Huang等〔5〕發現miR-196a還可促進胰腺癌的進展，下調其水平可抑制腫瘤發展。以上提示miR-196a具有癌基因的作用，可作為癌癥治療的靶點。

本研究提示mir-196a在肺癌的發生發展中可能起重要作用。通過qPCR驗證轉染效果發現，轉染inhibitor可降低miR-196a水平，而轉染mimics可升高miR-196a水平，且轉染效果可持續至96 h，為研究其對肺癌細胞的影響提供了基礎。MTT檢測表明miR-196a可促進肺癌細胞A549細胞的增殖，具有一定的癌基因作用。EMT是癌細胞發生侵襲轉移的重要步驟，作為生理病理現象，以上皮表型缺失及間質表型的獲得為主要表現〔7〕。CK18和E-cadherin為經典的上皮表型標志物〔8～10〕，而α-SMA和FN為間質表型標志物〔11〕，因此其水平變化可用于評價EMT變化。本研究提示上調miR-196a表達可促進EMT過程。而且miR-196a可促進A549的EMT過程，但對于侵襲轉移的影響將是下步的研究重點。

綜上所述，A549細胞中miR-196a呈高表達，抑制miR-196a表達可抑制A549細胞增殖和EMT，而升高miR-196a表達可促進A549細胞增殖和EMT。

4參考文獻

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〔2013-04-25修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)