冰片提取物對沙眼衣原體感染Hela細胞CT703及CT259表達的影響

冰片提取物對沙眼衣原體感染Hela細胞CT703及CT259表達的影響

郭翠玲趙仲平湯愛燦歐波

(海南省中醫院眼科中心，海南海口570203)

摘要〔〕目的探討冰片提取物對沙眼衣原體感染Hela細胞CT703及CT259表達的影響。方法建立沙眼衣原體感染Hela細胞模型，將被感染后的Hela細胞放入A、B兩培養瓶中培養，其中A培養瓶培養基中加入冰片提取物0.3 g，而B培養瓶只是加入等量的培養基，采用RT-PCR及 Western印跡法檢測選取培養6、12、24 h后Hela細胞中CT703及CT259基因及蛋白表達水平。結果A培養瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養時間的延長而逐漸降低(P<0.05)；B培養瓶中被沙眼衣原體感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養時間的延長未出現明顯變化(P>0.05)。A培養瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨著培養時間的延長而逐漸降低(P<0.05)；B培養瓶中被沙眼衣原體感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨著培養時間的延長未出現明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。結論被沙眼衣原體感染的Hela細胞中的CT703及CT259基因及蛋白表達均處于高水平，冰片提取物能夠明顯抑制Hela細胞中CT703及CT259基因及蛋白表達，臨床能夠用于沙眼衣原體感染的治療。

關鍵詞〔〕冰片提取物；沙眼衣原體；Hela細胞；CT703；CT259

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：郭翠玲(1972-),女，副主任醫師，主要從事眼底疾病臨床與基礎研究。

沙眼衣原體(Ct)是一種具有細胞內二相性生活周期的嚴格細胞內寄生的微生物，內含代謝活躍、無感染性的網狀體和感染性強、代謝不活躍的原體。沙眼衣原體感染人后最常見是引起沙眼，還會引起包涵體結膜炎、輸卵管炎、宮頸炎以及一些性傳染性疾病，有關研究報道，人類生殖道感染沙眼衣原體后能夠增加一些傳染性疾病和生殖系統疾病的概率，如艾滋病、宮頸癌等〔1〕。沙眼衣原體能夠干擾宿主細胞信號傳導途徑，從而影響生物學行為，躲避宿主對其免疫，導致機體持續處于感染狀態〔2〕。在持續感染狀態下，衣原體在宿主細胞內不再繼續復制增殖，處于代謝率低下狀態，但網狀體將異常增大，很難被機體剔除，當宿主免疫系統出現紊亂或者低下或者其他微生物侵襲宿主時，持續感染狀態下的衣原體能夠恢復期正常的感染性，再次分化感染性強的原體。沙眼衣原體持續感染是致宿主發生疾病的一個重要方面。本文探究沙眼衣原體基因CT703、CT259在持續感染時的表達水平變化以及冰片提取物對沙眼衣原體的作用。

1資料與方法

1.1材料冰片提取物購于陜西鈺堂生物科技發展有限公司；人宮頸癌Hela細胞株購于中國醫學科學院基礎研究所；沙眼衣原體購于美國德克薩斯州健康科學中心；RPMI-1640培養基及Trizol試劑均購于購于美國Gibco公司；RT-PCR試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于美國Promega公司；兔抗人CT703抗體、兔抗人CT259抗體、引物、Tap酶和DAB顯色劑購于Cell Signalling Technology 公司。

1.2Hela細胞培養無菌操作下，取人宮頸癌Hela細胞置于RPMI-1640培養基中，在37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中培養，培養24 h至生長對數期，用0.25%胰酶消化細胞，10%體積分數的小牛血清培養基終止消化，按照1∶3傳代培養，每3天傳代培養一次。

1.3沙眼衣原體感染模型建立預先置有玻片的24孔板內加入1 ml濃度為2×105/ml的人宮頸癌Hela細胞懸液，置于37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中培養，24 h長成單層后，抽取并除去上清液，向每孔加入2 μl感染復數為1的沙眼衣原體懸液，在適宜環境中培養2 h后，除去上清液，并加入適量的RPMI-1640培養基繼續培養。在沙眼衣原體感染后24、48 h后取出玻片，采用姬姆薩染色成功，于光學顯微鏡及電子顯微鏡下觀察。

1.4分組及方法向預先準備好的A、B兩個50 cm3培養瓶中分別加入濃度為2×105/ml的人宮頸癌Hela細胞懸液10 ml，置于37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中培養，24 h長成單層后，抽取并除去上清液，除去上清液，向每個培養瓶中加入50 μl感染復數為1的沙眼衣原體懸液，在適宜環境中培養2 h后，除去上清液，并加入適量的RPMI-1640培養基繼續培養。培養24 h后，向A培養瓶加入0.3 g冰片提取物，向B培養瓶加入等量RPMI-1640培養基，置于適宜環境中繼續培養，分別取培養6、12、24 h后細胞備用。

1.5RT-PCR法檢測不同時間段Hela細胞CT703、CT259基因表達水平

1.5.1提取總RNA分別取A、B兩培養瓶不同時間段Hela細胞置于0.2%膠原酶中消化，采用D-Hanks液清洗，4℃水中30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細胞沉淀，向單細胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取Hela細胞中總RNA。實驗操作按產品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的OD260/OD280確定總RNA純度。

1.5.2RT-PCR根據逆轉錄試劑盒要求進行反轉錄反應操作，按照相關文獻資料設計PCR中內參照CT110、CT703和CT259引物，將RNA模板、引物、5倍緩沖液和RNase-free水溶解并置于冰上備用，將2 μl引物混合物試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應體系的第一部分，混勻。PCR反應體系經過PCR反應條件的優化，PCR循環條件為94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35個循環，最后72℃再延伸5 min。引物序列：CT259-正義鏈5′-TGGAATTCGGATTGTTGCGGATTTCG-3′,反義鏈5′-CTCGAGCGTTAACGCATCCGAACCAG-3′，產物747 bp；CT703-正義鏈5′-ACTCGTAAGGTTTCGTCA-3′,反義鏈5′-CTCGTAAATAAATGGGACTT-3′,產物352 bp;CT110-正義鏈5′-CTAATGAGTTGACCGCCAGT-3′,反義鏈5′-GACGCTTTGGTTCTAATCTACGA-3′,產物323 bp。

1.5.3結果分析PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較CT703和CT259產物條帶的吸光度值，并與CT110條帶光密度值比較，計算出CT703和CT259在Hela細胞中mRNA表達含量相對值。

1.6Western印跡法檢測不同時間段Hela細胞CT703、CT259蛋白表達無菌操作下，分別取A、B兩培養瓶不同時間段Hela細胞，將選取好的Hela細胞經PBS緩沖液洗滌，洗滌后離心收集，用冰冷PBS洗滌細胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液，即胞質蛋白。采用BCA法對樣品蛋白質進行蛋白定量。調整樣品蛋白量為30～40 μg后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將蛋白質轉移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min后，PBST溶解封閉PVDF膜2 h。繼而加入兔抗人CT703抗體、兔抗人 CT259抗體(按1∶1 000稀釋)或抗β-actin(1∶2 000稀釋)，置于4℃環境中過夜。PBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，溫室孵育2 h。再次用PBST洗滌3次，每次10 min。將PVDF膜ECL顯色，在暗室中將PBVF曝光于X光片中，用凝膠成像系統掃描分析結果。

1.7統計學方法采用SPSS17.0進行t檢驗。

2結果

2.1總RNA提取結果紫外分光光度法測定中可知Hela細胞CT703、CT259 RNA OD260/OD280值在1.8～2.0之間，在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可觀察到28S、18S、5S三條產物條帶，說明提取Hela細胞中的總RNA完整性較好。如圖1。

2.2不同時間段Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達比較A培養瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養時間的延長而逐漸降低，且培養24 h后Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平明顯低于培養6 h(P<0.05)；而B培養瓶中被感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養時間的延長未出現明顯變化(P>0.05)；A培養瓶培養24 h后Hela細胞CT703、CT259 mRNA表

達水平明顯低于B培養瓶(P<0.01)。見表1，圖2。

2.3不同時間段Hela細胞CT703、CT259蛋白表達比較A培養瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨培養時間延長而逐漸降低，且培養24 h后Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平明顯低于培養6 h(P<0.05)；而B培養瓶中被感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨著培養時間的延長未出現明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)；A培養瓶培養24 h后Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平明顯低于B培養瓶(P<0.01)。見表2，圖3。

圖1　RNA樣品凝膠電泳結果

圖2　沙眼衣原體感染Hela細胞不同時間點CT259、CT703、 CT110 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

組別CT7036h12h24hCT2596h12h24hA培養瓶0.64±0.110.51±0.130.34±0.061)2)0.71±0.120.43±0.120.31±0.041)2)B培養瓶0.66±0.050.71±0.120.69±0.110.72±0.130.77±0.110.78±0.12

與培養6 h比較：1)P<0.05；與B培養瓶比較：2)P<0.01，下表同

表2　不同時間段Hela細胞CT703、CT259蛋白表達比較

圖3　沙眼衣原體感染Hela細胞不同時間點CT259、CT703、 CT110蛋白表達

3討論

沙眼衣原體寄生宿主細胞后期代謝活躍，無感染性的網狀體在細胞內逐漸增大，當宿主免疫功能出現低下或其他微生物侵襲宿主時，衣原體會趁機恢復其二相性生活周期，分化成具有強傳染性的原體，從而導致宿主發生病變〔3〕。研究表明，沙眼衣原體持續感染狀態下基因轉錄發生很大的變化，與信號傳導有關的基因會隨著沙眼衣原體寄生宿主的狀態而發生改變，轉變或上調或下調〔4〕。

本研究結果顯示，當感染一定時間后，隨著時間后的延長Hela細胞中CT259、CT703基因及蛋白表達量為出現明顯變化，說明持續感染狀態下，沙眼衣原體在宿主細胞內處于休眠狀態，維持無感染性的網狀體生活相，以保護沙眼衣原體的活性。當宿主機體處于低水平的免疫狀態或者其他微生物侵襲時，沙眼衣原體將恢復其感染狀態，分化具有強感染性的原體，破壞宿主細胞、組織從而導致疾病發生〔5～7〕。本研究說明冰片提取物能夠協助宿主免疫系統清除因持續感染而逐漸增多的沙眼衣原體網狀體，從而有效阻止沙眼衣原體所導致宿主細胞、組織損傷發生疾病。冰片提取物主要成分為龍腦、異龍腦、右旋龍腦等化合物〔8〕。龍腦、異龍腦均具有耐缺氧作用，具有較好的鎮靜、止痛功效，較高濃度的龍腦及異龍腦對葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌以及皮膚真菌等均有較強的抑制作用〔9～11〕。冰片提取物其化學成分能夠激活宿主的巨噬細胞、自然殺傷細胞活性，提高單核細胞的循環和免疫細胞表面抗原和抗體的表達，增強宿主免疫系統對沙眼衣原體網狀體的識別和清除，有效阻止了網狀體轉化為具有感染性、致病性的原體〔12〕。

綜上所述，沙眼衣原體寄生宿主細胞后干擾細胞信號傳導，躲避宿主免疫系統的清除，進而轉化為無感染性的網狀體，

使沙眼衣原體感染后Hela細胞中CT259、CT703基因及蛋白表達處于高水平狀態。冰片提取物通過增強對網狀體的識別和宿主免疫系統，有效的清除長期寄生于細胞內的沙眼衣原體。冰片提取物能夠清除機體內寄生的沙眼衣原體，有利于提高沙眼衣原體感染所致疾病的治療，對臨床具有重要的指導意義。

4參考文獻

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〔2013-12-13修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)