Parkin基因突變和線粒體功能紊亂與帕金森病的相關性

Parkin基因突變和線粒體功能紊亂與帕金森病的相關性

姜立志1沈麗華孫翠

(南通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，江蘇南通226001)

關鍵詞〔〕帕金森病；Parkin基因；線粒體功能

中圖分類號〔〕R742.5〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：沈麗華(1969-)，女，碩士生導師，主任醫(yī)師,主要從事神經(jīng)元變形性疾病的臨床研究。

據(jù)最新流行病學統(tǒng)計，我國65歲以上人群中帕金森病(PD)發(fā)病率與西方發(fā)達國家相似，約為1.7%，且發(fā)病率隨著年齡的增加而增加〔1〕。但目前對于PD的確切發(fā)病機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，老年化因素、環(huán)境因素、遺傳因素均與PD的發(fā)病相關。流行病學研究顯示，10%～15%的PD患者有家族史〔2〕。家族性PD相關基因見文獻〔3〕，家族性PD與基因突變有關，這一發(fā)現(xiàn)為疾病的細胞和分子路徑提供了一個新的入口〔4〕。迄今為止，已確定的PD相關易感基因有α-synuclein、Parkin、UCH-L1、DJ-1、PINK1、LRRK2、ATP13A2 及HTRA2，其中Parkin、DJ-1、PINK1 與常染色體隱性遺傳性PD相關〔5〕。

1Parkin與PD

Parkin最早是Matsumine等〔6〕在研究日本13個常染色體隱性遺傳性青少年型PD家系時發(fā)現(xiàn)，由Kitada首先克隆并命名〔7〕。Parkin基因的突變在家族性隱性早發(fā)性PD中占50%，在早發(fā)型散發(fā)病例中也占據(jù)了15%～20%，發(fā)病年齡≤50歲〔8〕。此類患者的特異性臨床特點包括：早期出現(xiàn)運動癥狀伴有緩慢的臨床過程、對低劑量的多巴胺敏感、長期治療可以出現(xiàn)運動障礙的并發(fā)癥，且常伴有焦慮、精神錯亂、強迫癥、抑郁〔9〕。Parkin蛋白由3個功能域構成：①氨基端的泛素樣區(qū)(Ub1)，其功能是與底物結合；②羥基端的環(huán)指結構，其功能主要是連接泛素結合酶，作為新的鋅指蛋白，控制細胞生長、分化與發(fā)育，可能與真核細胞分化、成長和死亡控制有關；③前兩者的鏈接區(qū)，前兩者為功能區(qū)，在遺傳上高度保守。臨床資料顯示大片段缺失突變或點突變的突變熱點區(qū)分別在這兩個保守區(qū)〔10〕。見圖1。

圖1　Parkin分子結構及PD相關突變的示意圖 〔11〕

1十堰市鄖西縣人民醫(yī)院神經(jīng)內科

第一作者：姜立志(1983-)，男，在讀碩士,主要從事神經(jīng)元變形性疾病的臨床研究。

Parkin的分布廣泛，在腦和外周組織中均有表達。早期的研究報道發(fā)現(xiàn)，Parkin在腦的黑質和藍斑處的神經(jīng)元有豐富的表達〔12〕。目前研究已證實parkin也可存在于外周組織細胞的胞質、線粒體和內質網(wǎng)中〔13〕。Parkin蛋白具有多重功能，在底物蛋白降解、調節(jié)基因轉錄及保護神經(jīng)細胞等方面都起著十分廣泛的作用，并且在PD的氧化應激、線粒體損傷及蛋白酶體功能紊亂中起著重要作用。

1.1Parkin與泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)UPS是細胞內一種重要的蛋白降解途徑。Parkin最初是作為E3泛素連接酶被報道，它通過蛋白酶體介導清除細胞中的各種物質〔14〕。細胞內目標蛋白質的特異性降解依賴于泛素分子轉運者通過酶的級聯(lián)反應識別目標蛋白，最終通過UPS降解。因此，UPS功能障礙或者超負荷會導致蛋白質底物的蓄積，在多巴胺神經(jīng)元中蓄積的蛋白質底物導致多巴胺神經(jīng)元變性，在腦組織中形成包涵體，稱路易小體。Parkin蛋白的底物蛋白已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種，如：DJ-1〔15〕、Hsp70〔16〕、PICK1〔17〕、α-酮戊二酸載體蛋白〔18〕等。見圖2。

圖2　UPS降解底物的示意圖 〔19〕

1.2Parkin與線粒體功能線粒體均勻地分布在細胞質中，是物質氧化能量供應的場所，為機體的生命活動提供所需要的能量，同時介導細胞程序化凋亡。PD患者的中腦黑質細胞中，存在一段4 977bp長的DNA缺失，結果導致神經(jīng)元細胞中線粒體功能缺陷，進而引起神經(jīng)元能量代謝障礙。因此，線粒體損傷或線粒體功能紊亂是PD發(fā)病的主要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)Parkin與線粒體的功能和形態(tài)有著密切的聯(lián)系。Parkin與線粒體之間的聯(lián)系最初被觀察是在神經(jīng)酰胺治療細胞中阻止細胞色素C的釋放〔20〕。后來在Parkin基因敲除的動物模型研究中證實Parkin基因在維持線粒體功能中扮演著重要的角色：Parkin敲除鼠出現(xiàn)了線粒體功能紊亂和氧化損傷，Parkin基因剔除果蠅中發(fā)現(xiàn)線粒體病變和DA神經(jīng)元丟失〔20，21〕。同時細胞離體實驗也證明了Parkin選擇性泛素化凋亡蛋白(Bax)，通過阻止線粒體免受Bax的損傷，從而達到抗凋亡作用〔22〕。在線粒體毒素誘導的細胞損傷模型中，Parkin的高表達可以對細胞起到保護作用；而Parkin突變時Bax的表達明顯增高，細胞凋亡增加〔22〕。Parkin在線粒體的功能調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。它通過與線粒體DNA直接結合，保護線粒體DNA免受活性氧(ROS)的損傷并激發(fā)線粒體的自我修復過程〔23〕。在增殖的細胞中，Parkin的過表達可以增加線粒體DNA的轉錄和修復水平，而且Parkin可以通過結合線粒體轉錄因子A(TFAM)來增加介導的線粒體蛋白轉錄，從而維持線粒體穩(wěn)態(tài)〔24，25〕。同時線粒體的應激能通過轉錄激活因子(ATF)4上調誘導特殊ParkinmRNA和蛋白的水平增加〔26〕。

1.3Parkin與線粒體自噬許多研究已證實Parkin在PINK1的參與下通過選擇性自噬功能障礙的線粒體，從而參與線粒體的質量控制〔27〕，減少氧化應激，保護細胞免受氧化損傷。自噬是一個動態(tài)的過程，它可分為4個階段：①細胞在饑餓、氧化損傷等情況下，一個杯狀膜結構吞噬胞質中的被降解物；②隨后這個膜結構逐漸延伸，形成一個囊狀結構，也叫自噬體；③自噬體形成后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體；④形成的自噬溶酶體允許水解酶降解內部的生物化學部件〔28〕。在正常狀態(tài)下，Parkin絕大部分定位于胞質中，但有實驗證明在線粒體氧化劑羰基氰酯-3-氯苯基腙(CCCP)處理下的細胞中Parkin從胞質遷移到了線粒體，它通過激活自噬系統(tǒng)、調節(jié)自噬水平以降解受損的線粒體〔13〕。

2線粒體功能紊亂與PD

線粒體在大多數(shù)真核生物的代謝過程中提供能量，調節(jié)細胞內鈣離子的水平，調控細胞凋亡；清除去極化的自噬體或損傷的線粒體。線粒體有內外兩層膜，折疊形成脊；傳統(tǒng)上被認為是獨立的細胞器，線粒體形成復雜的分枝網(wǎng)是由于它具有移動、融合的活動能力。豐富的線粒體形式在不同的組織中取決于他們對氧化磷酸化的依賴。神經(jīng)元及心肌、骨骼肌含有較高密度的線粒體，也說明他們特別容易受到線粒體損傷引起的能量缺乏的侵害〔29〕。線粒體穩(wěn)態(tài)的改變在PD患者的組織中已被證實，如細胞培養(yǎng)和基因檢測〔30〕。

2.1線粒體功能紊亂與氧化應激氧化應激可被解釋為氧化劑和抗氧化劑平衡紊亂時的條件反射，前者是一種潛在的細胞損傷〔31〕。在PD的發(fā)病機制中氧化應激起重要作用。線粒體在氧化呼吸的過程中消耗氧氣同時傳遞電子，電子通過氧化呼吸傳遞給氧生成水。然而線粒體功能紊亂，會使氧不能得到有效利用，導致大量電子外露，直接對氧進行單電子還原，生成氧氣離子。氧離子又被位于線粒體基質的超氧化物歧化酶(SOD)歧化生成氧氣(O2)和過氧化氫水(H2O2)，因此就形成了氧自由基(O-)。氧自由基可以引起生物大分子，如蛋白質、核酸和膜磷脂等損傷，破壞細胞結構，干擾細胞功能和能量代謝〔32〕。在細胞中過多的O-可能導致細胞膜上脂質雙分子層的氧化損傷，導致神經(jīng)元功能破壞和細胞壞死；H2O2可以穿過細胞膜在細胞內發(fā)揮它的生物學效應；除此之外金屬的氧化還原反應也可成為細胞潛在的毒性〔33〕。

氧化應激使神經(jīng)元平衡紊亂引起脂質過氧化物的產(chǎn)生，蛋白質改變，DNA突變，同時也引起線粒體通透性轉換孔的形成，因此能量供應減低，線粒體動力學異常，干擾線粒體的轉運能力，減少神經(jīng)元適應性，最終導致神經(jīng)元死亡〔34〕。線粒體通透性轉換孔形成的主要后果包括鈣快速流出線粒體，減少質子梯度，損傷線粒體呼吸，增加ROS生成，釋放凋亡因子到細胞質，線粒體腫脹，線粒體膜破裂〔34〕。

人體細胞中也存在著氧化應激的防御系統(tǒng)，如谷胱甘肽(GSH)、抗氧化劑酶及維生素E(VE)等〔35〕。細胞內高濃度的GSH能拮抗不同的O-，另外，活細胞內各種大量的酶也直接或間接參與O-的清除，如GSH還原酶不僅負責GSH的循環(huán)，對氧化物的內源性解毒也起到重要作用〔36〕。疾病早期SOD、GSH過氧化物酶(GSH-Px)升高可能為氧化應激所致。

在生物體內，腦組織更易受氧化反應及其產(chǎn)生的自由基的損害，這是因為：①它含有大量的、高濃度的不飽和脂肪酸；②大腦需要相對更多的O2供應；③腦內自由基清除功能相對缺乏，與肝臟相比，它的GSH、GSH-Px及VE含量較低；④腦組織內鐵的含量相對較高。以上幾點在黑質中表現(xiàn)得最為突出〔37〕。因此，氧化應激水平的增高更容易損傷多巴胺能神經(jīng)元。此外，氧化反應的產(chǎn)物影響膜配體與受體的結合〔31〕，如影響多巴胺與多巴胺受體的結合，抑制乙酰膽堿的能力下降。

2.2線粒體功能紊亂與細胞代謝哺乳動物所吸入的O290%進入細胞，在線粒體通過氧化磷酸化為生物體提供80%的ATP，然而20%的氧進入細胞后生成活性氧，他們帶有孤電子被稱為自由基〔31〕。細胞的氧化呼吸在線粒體中進行，在酶的催化作用下氨基酸、脂肪、糖等供能物質氧化而釋放能量，通過電子傳遞和氧化磷酸化將這些能量以高能磷酸鍵的形式儲存在ATP中，為細胞的各種生命活動提供能量。如在神經(jīng)元的電子傳遞中所消耗的能量來源于線粒體〔38〕，也可以說神經(jīng)元的興奮性高度依賴線粒體產(chǎn)生的ATP。

2.3線粒體與細胞凋亡有證據(jù)證明，PD患者中存在線粒體復合物Ⅰ及氧化還原能力降低，ROS生成增加及氧化應激的發(fā)生。上述現(xiàn)象導致線粒體膜電位去極化進而誘導線粒體膜通透性轉運孔道開放，大量小分子蛋白物質包括細胞色素C、Bax和凋亡誘導因子等從線粒體膜通透性轉運通道釋放出來，激活半胱冬肽酶依賴性和非依賴性細胞凋亡的發(fā)生〔7〕。同時由于ATP的供應不足，Ga2+內流，細胞內Ga2+濃度增加導致線粒體Na2+、Ga2+質子泵功能下降以及細胞通透性改變，當膜的表面孔道開放時，可釋放細胞色素C，誘導凋亡因子分泌最終觸發(fā)凋亡過程。

3Parkin基因突變與線粒體功能紊亂

Parkin基因的突變具有明顯的多樣性，該基因有12個外顯子，均可有不同程度的序列改變，其中以4、6、7號外顯子最為常見，他們都處于突變的熱點區(qū)域〔39〕。Parkin基因不僅作為泛素連接酶通過UPS參與蛋白質底物的降解，也參與線粒體的功能調節(jié)和形態(tài)維持〔7〕，同時和線粒體的自噬也有關系。這就帶來一個問題，Parkin基因不同位點的突變可能造成不同系統(tǒng)的功能改變，在PD的發(fā)病機制中也扮演著不同的角色。

近幾年，有關報道認為Parkin2、3外顯子的缺失性突變可能是導致線粒體功能紊亂的重要因素。Palacino等〔40〕發(fā)現(xiàn)在Parkin3號外顯子剔除的小鼠中出現(xiàn)了線粒體氧化應激相關蛋白的減少、線粒體氧化呼吸作用減少和隨著年齡增長的氧化損傷增加的現(xiàn)象。Pacelli等〔20〕在2例早發(fā)性PD患者的皮膚初級纖維母細胞的研究中發(fā)現(xiàn)以前未報道過的復合雜合突變：Parkin基因的2～3號外顯子或3號外顯子缺失，導致完整的整段蛋白丟失。并觀察到幾個超微結構的畸形，最主要的是線粒體，認為Parkin基因2、3號外顯子可能參與線粒體質量控制系統(tǒng)，這一完整蛋白的丟失與能量代謝損傷有關，解除了對ROS產(chǎn)生的抑制，結果是脂質氧化和過氧化物酶改變。同時他們還認為脂質過氧化反應的產(chǎn)物是PD發(fā)病機制中早期標志，甚至在臨床表現(xiàn)之前出現(xiàn)，直到異常增高到一定水平才會出現(xiàn)臨床癥狀。Gaweda-Walerych等〔25〕在波蘭PD患者中研究Parkin的多態(tài)性與線粒體單倍的相互作用時發(fā)現(xiàn)：Parkin基因2號外顯子的缺失與TFAM和單倍體mtDNA相互關系。

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〔2013-06-19修回〕

(編輯安冉冉/杜娟)