菜籽油磷脂酶C脫膠工藝優化及效果分析*

葉展，冉玉兵，胡傳榮，2，何東平，2，劉零怡，2，亞森·玉山，羅質，2

1(武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢，430023)2(國家糧食局糧油資源綜合開發工程技術研究中心，湖北武漢，430023)

3(湖北奧星糧油工業有限公司，湖北 襄陽，441800)

目前，油脂脫膠較多采用傳統脫膠方法，如水化脫膠、酸法脫膠、超級脫膠、聯合脫膠等，傳統脫膠方法可以有效地除去水化磷脂，但很難除去非水化磷脂，但很難除去非水化磷脂［1-2］。酶法脫膠通過添加磷脂酶，使非水化磷脂水解成溶血性磷脂，溶血性磷脂具有良好的親水性，可以利用水化方法去除［3］。

酶法脫膠是一種經濟環保的油脂精煉方法，磷脂酶根據其作用于磷脂的位點不同分為磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)4種，除了磷脂酶D由于酶源比較狹窄、含量低、提純困難，目前研究較少之外，前三者已有大量研究［4］，但是磷脂酶C脫膠水解產物為甘油二酯及有機磷酸酯(磷酸膽堿、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)，脫膠過程不會產生其他副產品，安全性顯得更高，并且脫膠過程中只需1% ～2%的水分，可避免大量廢水的產生，降低了對環境的壓力［5］，近幾年更是得到廣泛關注和研究。

本文研究了磷脂酶C對菜籽毛油的脫膠工藝，并對工藝進行試驗優化，同時對毛油與酶法脫膠油二者甘油酯組成的差異，水化脫膠、酶法脫膠后的磷脂進行了對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽毛油(磷含量為693 mg/kg)，湖北奧星糧油工業有限公司提供;磷脂酶C，由華中農業大學生命科學技術學院生產提供(實測酶活9 000 U/g)，雙蒸水稀釋1 000倍冷藏備用;檸檬酸、NaOH等為分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測器(TLCFID)，日本島津公司;Rancimat743型油脂氧化穩定性分析儀，瑞士萬通公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠;XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司;SHA-CA數顯水浴恒溫振蕩器，江蘇東鵬儀器制造有限公司;TD5A臺式離心機，湖南凱達科學儀器有限公司;SRJX-4-13電阻爐，北京市永光明醫療儀器廠;UV-1600型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本指標測定方法

PLC活力測定。采用 NPPC法［6］(p-nitrophenylphorylchoine，NPPC，對硝基苯磷酸膽堿)。以NPPC作為PLC作用底物，水解產物一對硝基苯酚是一種黃色物質，在410 nm處有最大吸收。在pH 7.2、37℃條件下，每分鐘催化l nmol NPPC水解的酶量定義為一個酶活單位［7］。

磷含量的測定:參照GB/T 5537-2008。

1.2.2 菜籽油磷脂酶C脫膠工藝

取60 g過濾菜籽毛油水浴至70℃，添加油重1.2%質量分數為35%檸檬酸溶液，15 000 r/min均質3 min，45℃水浴恒溫振蕩滯留反應30 min(速率200 r/min)，結束后加稀釋酶液 12 mL/kg，15 000 r/min均質3 min，加水40 mL/kg(溫度比油溫稍高)，45℃水浴恒溫振蕩(速率200 r/min)，進行酶法脫膠反應90 min，反應結束，取出90℃水浴加熱滅酶，離心機分離膠質和油(轉速4 500 r/min，離心時間10 min)，油樣進行真空干燥(干燥條件:溫度140℃，壓力≤4.0 kPa，時間30 min)后即為PLC脫膠油。

1.2.3 菜籽油PLC脫膠單因素試驗

取菜籽毛油，采用1.2.2所述脫膠工藝，進行菜籽油酶法脫膠，分別研究檸檬酸溶液用量(0.6、2.4、4.2、6.0、7.8、9.6 mL/kg)、加酶量(4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0 mL/kg)、加水量(20、30、40、50、60、70 mL/kg)、反應溫度(25、35、45、55、65、75 ℃)和反應時間(30、60、90、120、150、180 min)這 5 個因素對菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響。

1.2.4 PLC脫膠工藝條件的優化

在單因素實驗基礎上，利用Design Expert 8.0.5軟件中心組合設計(central composite design，CCD)模塊中的二次回歸正交中心旋轉組合設計了一組3因素5水平共計23次的試驗(Full CCD設計)，其中析因部分試驗次數為14次，星點數為5次，為了保證均一精密性并且減小試驗誤差，將中心重復數手動調整為9次，共計23個試驗點，來確定PLC脫膠工藝最優條件組合［8］。試驗設計的因素及水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code factors and levels of the CCD experiment design

1.2.5 菜籽油磷脂酶C脫膠效果分析

甘油酯含量分析。實驗采用棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測器(TLC-FID)定量檢測菜籽毛油和磷脂酶C脫膠油中甘油酯的含量。取1滴油樣于小試管中，將樣品用1 mL的正己烷溶解，取1 μL樣品點于薄層色譜棒上，在正己烷/無水乙醚/冰乙酸(體積比55∶15∶1)溶劑體系中展開，然后放入FID裝置中進行分析。TLC-FID分析條件:氫氣流速:90 mL/min;空氣流速:2.0 L/min;掃描速度:30s/棒。

溶血性磷脂含量分析。水化脫膠、酶法脫膠后的磷脂先用丙酮進行純化處理，實驗采用棒狀薄層色譜—氫火焰離子化檢測器(TLC-FID)定量檢測溶血磷脂的含量。取0.30 g純化樣品于小試管中，將樣品用1 mL的正己烷溶解，取1 μL樣品點于薄層色譜棒上，在三氯甲烷/甲醇/水(體積比65∶35∶5)溶劑體系中展開，然后放入FID裝置中進行分析，分析條件同1.2.5.1。

1.2.6 數據處理

采用Excel繪制試驗表格;采用Origin 8.5繪制單因素試驗曲線圖和條形圖;采用 Design Expert 8.0.5繪制響應面等高線圖，并進行方差分析。

2 實驗結果與分析

2.1 菜籽油PLC脫膠單因素試驗

2.1.1 檸檬酸添加量對脫膠效果的影響

檸檬酸溶液添加量對菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖1所示。檸檬酸溶液添加量在0.6～9.6 mL/kg內變化時，PLC脫膠油磷含量先降低后升高，在檸檬酸溶液加入量為6.0 mL/kg時，脫膠油磷含量最低。對油水混合物的pH進行測定，pH值為4.57，表明磷脂酶C最適 pH 值為4.57，楊嬌［9］的研究表明，磷脂酶C適宜于偏酸性環境，磷脂酶C催化的脫膠反應體系的pH值應設定在4.5～5.2，pH值過高或者過低，都會導致磷脂酶的部分或全部活性喪失。因此，為了進一步確定最適酶反應條件，檸檬酸溶液加入量宜在4.2～7.8 mL/kg內作進一步優化。

圖1 檸檬酸添加量對PLC脫膠油磷含量的影響Fig.1 Effect of citric acid dosage on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.2 加酶量對脫膠效果的影響

加酶量對菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖2所示。由圖2可知，隨著稀釋酶液的不斷增加，脫膠油中磷含量急劇下降，磷脂酶液加入量超過12 mL/kg后，脫膠油磷含量降低緩慢，下降趨勢相對平緩。考慮到磷脂酶C的生產成本較高，結合實驗實際情況，磷脂酶C稀釋酶液加入量需要在12 mL/kg左右進行進一步試驗優化，以確定適宜用量。

圖2 加酶量對PLC脫膠油磷含量的影響Fig.2 Effect of PLC dosage on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.3 加水量對脫膠效果的影響

加水量對菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖3所示。由圖3可知，隨著加水量的增加，脫膠油磷含量先降低，后增加，在加水量為40 mL/kg時，脫膠油磷含量最低，達到21.90 mg/kg。研究表明，酶法脫膠中，水的加入量過少，不利于磷脂微粒的絮凝，而加水量過多，會加劇油脂的乳化現象，以致后續的離心分離困難［10］，而且會產生更多的廢水，污染環境，這與油脂的適度加工相背。因此，本研究中，確定酶法脫膠用水量為40 mL/kg。

圖3 加水量對PLC脫膠油磷含量的影響Fig.3 Effect of amount of water addition on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.4 反應溫度對脫膠效果的影響

反應溫度對菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖4所示。在25～75℃內，脫膠油磷含量隨著溫度的升高先降低后升高，在45℃時，磷含量最低，脫膠效果較好，說明磷脂酶C最適溫度為45℃左右。實際上，磷脂酶C對溫度敏感，溫度較低時，其活性被抑制，催化功能降低，而溫度較高超過最適溫度時，酶的穩定性大大降低，半衰期縮短［11］，也導致其活性喪失，只有在最適溫度下，才能發揮出高能催化作用。因此，對脫膠溫度在45℃左右進行進一步優化，以找出最適溫度。

圖4 脫膠溫度對PLC脫膠油磷含量的影響Fig.4 Effect of degumming temperature on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.5 反應時間對脫膠效果的影響

反應時間對菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖5所示。由圖5可知，隨著時間的延長，脫膠油中磷含量先急劇下降，脫膠時間大于90 min后，脫膠油磷含量雖然降低，但降低幅度較小，趨于平緩，而且150 min以后脫膠油磷含量基本穩定不變，這是由于PLC可以催化磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷酯酰絲氨酸變為水化磷脂，但是其不能催化磷脂酰肌醇或磷脂酸反應［10，12］。因此考慮到精煉效率和成本，并結合是實際情況，脫膠時間確定為90 min較合理。

圖5 脫膠時間對PLC菜籽脫膠油磷含量的影響Fig.5 Effect of degumming time on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.2 菜籽油PLC脫膠工藝優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取檸檬酸加入量、磷脂酶C加入量和脫膠溫度，進行響應面優化試驗，按照1.2.4中響應面試驗設計，得到實驗設計方案及結果見表2。

得到二次回歸模型為:

Y=124.482 9-8.242 4A-11.652 0B-0.925 1C+0.086 9AB+0.057AC+0.015 9BC+0.596 0A2+0.416 7B2+0.008 2C2，方差分析見表3，由表3可知，該模型顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.077 3＞0.05)，且說明在預測磷脂酶C脫膠油磷含量方程的總的變異中，有98.99%是由獨立變量引起的，由此可知，該回歸模型包含了影響脫膠油磷含量的主要因素，可信度高，模型能較好的預測和分析磷脂酶C脫膠油中的磷含量。檸檬酸添加量、加酶量和酶解溫度對實驗結果的影響非常顯著，交互作用中，檸檬酸添加量和加酶量交互作用(如圖6所示)、加酶量和酶解溫度交互作用(如圖7所示)，對實驗結果影響顯著。根據F值可知，各因素對脫膠效果影響大小的次序為:加酶量＞酶解溫度＞檸檬酸添加量，這與單因素試驗結果也基本吻合。

表2 實驗設計方案及結果Table 2 Results of CCD experiment

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the response surface quadratic regression model

圖6 檸檬酸添加量和加酶量交互作用等高線圖Fig.6 Contour plots of the interaction effects of citric acid solution dosage and enzyme dosage

圖7 加酶量和酶解溫度交互作用等高線圖Fig.7 Contour plots of the interaction effects of enzyme dosage and enzymatic hydrolysis temperature

在Design-Expert 8.0.5軟件優化模塊中，將優化標準設置成為最小值，預測最佳脫膠條件為:檸檬酸添加量5.80 mL/kg，加酶量12.57 mL/kg，酶解溫度42.20℃，脫膠油磷含量為7.83 mg/kg。為了方便實際操作，將最優工藝條件修正為檸檬酸添加量5.80 mL/kg，加酶量12.60 mL/kg，酶解溫度42.20℃，并對結果進行驗證，在該條件下重復試驗3次，取平均值為7.85 mg/kg，這與所預測的最優值基本吻合，這也進一步表明了回歸模型的有效性［13］。

2.3 菜籽油磷脂酶C脫膠效果分析

2.3.1 甘油酯含量分析

在最優工藝條件下，對菜籽毛油進行酶法脫膠，采用1.2.5.1所述方法對菜籽毛油和磷脂酶C脫膠油中甘油酯含量進行分析，結果如圖8所示。

圖8 菜籽毛油和磷脂酶C脫膠菜籽油甘油酯和游離脂肪酸含量Fig.8 Glyceride content and FFA content of crude rapeseed oil and degummed oil

由圖8可知，菜籽毛油經磷脂酶C脫膠后，甘一酯和游離脂肪酸含量基本無變化，甘二酯含量從約2.5%增加到約6.5%，而甘三酯含量從約93%下降到約89%，這一變化主要原因在于磷脂酶C脫膠油中甘二酯含量的增加。磷脂酶C作用位點如圖9所示，磷脂酶C作用位點在磷脂分子的Sn-3位，實際上，磷脂經磷脂酶C水解后，產生甘油二酯(DAG)和磷酸化合物，甘油二酯作為油脂成分能夠保留在中性油中，因此，使用PLC脫膠能提高成品油得率，另一方面，水解產生的水溶性磷酸化合物，不具有乳化性從而減少了離心過程中因膠質夾帶中性油而造成的損失，降低了中性油損耗［5，14］。

圖9 磷脂酶C在磷脂分子中的作用位點注:X表示膽堿、乙醇胺、肌醇和氫等Fig.9 The action site of phospholipase C on Phospholipid molecule

2.3.2 溶血性磷脂含量分析

采用1.2.5.2所述方法分別對水化脫膠磷脂和磷脂酶C脫膠磷脂組成成分進行分析，根據溶血磷脂標樣進行定性，峰面積歸一化法定量，結果如圖10所示。

由圖10可知，水化脫膠磷脂與酶法脫膠磷脂相比，酶法脫膠磷脂中溶血磷脂含量比水化脫膠磷脂中的高出約50%，酶法脫膠的酶解率顯著升高，該結果這表明，磷脂酶C能夠使得菜籽油中的其他磷脂轉化為溶血磷脂，而溶血磷脂為水化磷脂，易除去。也說明磷脂酶C脫膠不但使菜籽油磷含量顯著降低，而且可提高油腳中價值更高的溶血磷脂含量，提高經濟效益［15］。

圖10 水化脫膠油和磷脂酶C脫膠油油腳磷脂組成Fig.10 The composition of phospholipid in water degumming and PLC degumming residue

3 結論

(1)在單因素基礎上，經過響應面法對PLC脫膠主要工藝參數進行了優化，并對結果進行方差分析，得到菜籽油磷脂酶C脫膠最佳工藝參數為檸檬酸添加量5.80 mL/kg，加酶量12.60 mL/kg，酶解溫度42.20℃，并對結果進行驗證，得磷脂酶C脫膠油磷含量為7.85 mg/kg。

(2)運用棒狀薄層色譜—氫火焰離子化檢測器分別對甘油酯含量和磷脂進行分析，進而探討菜籽油磷脂酶C脫膠的效果，結果顯示菜籽毛油經磷脂酶C脫膠后，甘一酯和游離脂肪酸含量基本無變化，甘二酯含量有一定增加，甘三酯含量有少量減少，中性油得率有所提高;同時，磷脂酶C脫膠磷脂中溶血磷脂含量遠高于水化脫膠磷脂中的溶血磷脂含量，這進一步表明磷脂酶C脫膠法在油脂得率和脫膠效果等方面要明顯優于水化脫膠法。

(3)磷脂酶C脫膠對油脂品質的影響雖有相關研究，但仍有所局限，因此，對于磷脂酶C是否能使后續精煉難度降低，并且提高成品油品質，需要做深入探討;除此之外，酶法脫膠還受到其他因素的影響，如金屬離子(Ca2+，Mg2+等)種類和含量、磷脂酶添加速率等，這些因素在后續的研究中也需進行深入研究。

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