通氣量對釀酒酵母GGSF16高濃度乙醇發酵的影響*

蔣凱，伍時華，趙東玲，張健，黃翠姬

(廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州，545006)

在高濃度乙醇發酵條件下，酵母細胞受到多種環境因素(高滲透壓、乙醇、代謝產物)的影響［1］，出現酵母細胞生長緩慢、發酵強度低、發酵效率不高等現象。從20世紀80年代起，人們逐漸認識到高濃度乙醇發酵過程中保持適當溶解氧的重要性［2］。在發酵過程中，通入適當的氧氣能夠促進酵母細胞生長［3］，有利于酵母細胞合成脂類物質(固醇和不飽和脂肪酸)［4］，提高酵母細胞的活性和乙醇耐受性［5］，解除代謝產物(CO2)對酵母細胞的抑制［6］。然而，通入過量的氧氣雖然有利于乙醇的積累，但是會使乙醇產率降低［7］。

本文研究通氣量對釀酒酵母GGSF16高濃度乙醇發酵的影響。探討了不同通氣量條件對酵母細胞生長、葡萄糖消耗和乙醇生成等參數的影響，旨在選擇最適的通氣量，為研究高濃度乙醇發酵打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母GGSF16(Saccharomyces cerevisiae GGSF16):廣西科技大學發酵工程研究所保藏。

1.1.2 培養基

一級種子培養基(g/L):葡萄糖20，酵母浸膏10，蛋白胨20，自然pH，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，115℃蒸汽滅菌30 min。

二級種子培養基(g/L):葡萄糖40，酵母浸膏10，蛋白胨20，自然pH，裝液量為200 mL/500 mL三角瓶，115℃蒸汽滅菌30 min。

發酵培養基(g/L):葡萄糖260，酵母浸膏10，蛋白胨20，自然pH，115℃蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 種子培養方法

取1環斜面菌體接入一級種子培養基中，32℃，搖床160 r/min條件下培養12 h后，4 000 r/min離心10 min，棄上清液并加入無菌水，制成10倍濃縮種子菌懸液，置于4℃冰箱保存。取置于4℃冰箱內液體菌種2 mL，接種至二級種子培養基中，32℃，搖床160 r/min條件下培養6 h后，4 000 r/min離心10 min，棄上清液并加入無菌水，制成10倍濃縮種子菌懸液。

1.1.4 5 L罐發酵方法

將40 mL種子菌懸液接入含4 L發酵培養基的5 L發酵罐(B.Braun)中，初始酵母干重為1.2 g/L。發酵過程中，保持攪拌轉速為200 r/min，自然pH，溫度為 32 ℃，進行不同通氣量(0、40、80、160、300 mL/min)發酵。

1.2 分析方法

從發酵0 h開始，每隔3 h取1次樣，發酵到6 h后，每隔6 h取1次樣。取發酵液1 mL，在4℃下，12 000 r/min離心3 min。用移液槍移取上清液，置于-60℃冰箱(用以測葡萄糖濃度和乙醇濃度)，加入與移取上清液等量的去離子水制備成菌懸液，置于4℃冰箱(用于測定生物量和細胞存活率)。

1.2.1 生物量的測定

將酵母菌懸液稀釋適當倍數后，用可見光分光光度計于波長600 nm處測定吸光度。利用吸光度與生物量干重之間的關系計算得到生物量干重。標準曲線:

y=0.423 4x+0.651 8，R2=0.995 5(x:吸光度;y:酵母細胞干重)

1.2.2 葡萄糖含量的測定

取上清液適當稀釋后，使用SBA-40生物傳感分析儀測定。

1.2.3 乙醇含量的測定

取上清液適當稀釋后，采用天美GC7890Ⅱ氣相色譜儀(FID檢測器)，以外標法分析乙醇濃度。色譜分析條件:30.0 m×320 μm×0.25 μm毛細管柱，氮氣為載氣，柱溫恒溫控制為70℃，進樣口溫度為190℃，檢測器溫度為220℃。

1.2.4 細胞活性的測定

亞甲基藍染色法［7］。

1.3 計算方法

發酵強度［g/(L·h)］=乙醇生成量(g/L)/發酵時間(h)

乙醇產率(g/g)=乙醇生成量(g/L)/葡萄糖消耗量(g/L)

酵母細胞產率(g/g)=酵母細胞量(g/L)/葡萄糖消耗量(g/L)

發酵效率/%=乙醇產率(g/g)/0.515(g/g)

葡萄糖消耗速率［g/(L·h)］=(S2-S1)/(t2-t1)

乙醇生成速率［g/(L·h)］=(E2-E1)/(t2-t1)

比生長速率(h-1)=(lnX2-lnX1)/(t2-t1)

比葡萄糖消耗速率［g葡萄糖/(g細胞·L·h)］=葡萄糖消耗速率/Xavg

比乙醇生成速率［g乙醇/(g細胞·L·h)］=乙醇生成速率/Xavg

其中 S，E，X，t，Xavg分別為葡萄糖質量濃度(g/L)，乙醇質量濃度(g/L)，細胞干重(g/L)，時間(h)，t1到t2之間的細胞干重平均值。

1.4 曲線下面積分析

酵母細胞生長和葡萄糖消耗曲線運用GraphPad Prism 5軟件進行繪制，并分別獲得酵母細胞生長和葡萄糖消耗曲線下面積(area under the fermentation curve/AUC)，記做細胞AUC和葡萄糖AUC。

2 結果與分析

2.1 通氣量條件對酵母細胞生長和存活率的影響

如圖1所示，在不同通氣量條件下(0、40、80、160、300 mL/min)，酵母細胞的生長趨勢基本保持一致，0～18 h為延滯期和對數生長期，18 h后為對數生長后期和穩定期。發酵0～3 h，酵母細胞量不隨通氣量的變化而改變。然而，發酵3 h后，通氣條件對酵母細胞生長的影響顯著。通氣條件下的最大菌體量明顯高于厭氧條件，比厭氧條件分別多95.6%，104%，107%，117%。這是因為發酵0～3 h時間段，發酵液中的溶氧量足以維持酵母細胞的生長，隨著酵母細胞量的不斷增加，細胞對氧的需求旺盛，由于沒有額外提供氧氣，發酵后期酵母細胞生長受到抑制［3］。另外，為了更全面地說明通氣條件對酵母細胞的生長具有促進作用，采用曲線下面積法進行整體評價［8］。細胞生長曲線下面積越大，說明酵母細胞生長越好。由圖1可以看出，發酵30 h后，酵母細胞生長趨于穩定，因此計算30 h前酵母細胞生長曲線下面積進行比較。從表1可知，在不同通氣量條件下，通氣量越大細胞AUC越大，進一步說明通氣有利于酵母細胞生長。

圖1 不同通氣量條件下細胞生長發酵過程曲線Fig.1 Profiles of biomass growth during the fermentation process under different aeration rates

表1 不同通氣量條件下細胞生長曲線下面積Table 1 Area under growth curves under different aeration rates

如圖2所示，酵母細胞的比生長速率呈現先升高后逐漸降低的趨勢。當乙醇濃度為10 g/L左右時(發酵6 h)，達到酵母細胞的最大比生長速率，其受通氣量的影響較大。當通氣量為300 mL/min時最大比生長速率最大(0.29 h-1)，厭氧條件下最大比生長速率最小(0.2 h-1)。隨著發酵的進行，乙醇濃度不斷增加，比生長速率不斷減小。厭氧發酵條件下，比生長速率下降最快，當乙醇濃度高于105 g/L左右時，厭氧條件下的比生長速率為負值，而通氣條件下的比生長速率依然保持相對較高的水平。說明通氧可以提高酵母細胞對乙醇的耐受性，此現象與Hyeon Beom Seo 等［5］研究相似。

圖2 不同通氣量條件下比生長速率發酵過程曲線Fig.2 Profiles of specific growth rate during the fermentation process under different aeration rates

如圖3所示，在整個發酵過程中，通氣條件下的酵母細胞存活率保持較高的水平并且基本保持不變。然而，厭氧條件下僅僅在發酵前期保持高存活率，隨著乙醇濃度的增加出現逐漸下降趨勢，尤其是發酵后期酵母細胞的存活率非常低。可能因為通氣條件下，酵母細胞大量合成脂類物質保護其細胞膜的完整性［4］。

圖3 不同通氣量條件下細胞存活率發酵過程曲線Fig.3 Profiles of cell viability during the fermentation process under different aeration rates

2.2 不同通氣量條件對葡萄糖消耗的影響

如圖4所示，在通氣條件下，酵母細胞完全消耗葡萄糖需要30 h，與厭氧條件相比(54 h)，大大縮短了葡萄糖的消耗時間，此現象與 Yen Han Lin等［9］一致。曲線下面積法可以整體地評價耗糖的快慢［10］，葡萄糖曲線下面積越小，說明耗糖越快。從表2可知，葡萄糖AUC160最小，葡萄糖AUC0最大，表明厭氧條件下耗糖最慢，通氣量為160 mL/min條件下耗糖最快，繼續增加通氣量不利于葡萄糖的消耗。

圖4 不同通氣量條件下葡萄糖消耗發酵過程曲線Fig.4 Profiles of glucose consumption during the fermentation process under different aeration rates

表2 不同通氣量條件下葡萄糖消耗曲線下面積Table 2 Area under glucose consumption curves under different aeration rates

如圖5所示，發酵0～6 h，不同通氣量下，葡萄糖消耗速率相差不大。發酵6～24 h，通氣條件下葡萄糖消耗速率明顯高于厭氧條件下葡萄糖消耗速率。其中，發酵6～12 h，葡萄糖消耗速率達到最大值，因為該時間段酵母處在對數生長期，發酵活力比較強，葡萄糖消耗速率分別為 9.75，15.73，15.95，16.67，15.58 g/(L·h)。發酵12 h后乙醇濃度不斷增加，對酵母細胞具有毒害作用，并且酵母細胞生長趨于穩定，葡萄糖消耗速率出現逐漸下降趨勢。發酵24～30 h時間段，厭氧條件下葡萄糖消耗速率高于通氣條件下葡萄糖消耗速率，主要因為通氣條件葡萄糖消耗完全，而厭氧條件下還有充足的葡萄糖供酵母細胞利用。另外，葡萄糖消耗速率與酵母細胞量有直接的關系，為了更深入地了解不同通氣量條件對葡萄糖消耗的影響，計算發酵過程中比葡萄糖消耗速率［g葡萄糖/(g細胞·L·h)］，見圖6。由圖5可知，發酵6～12 h時間段，葡萄糖消耗速率達到最大值，并且通氣條件下葡萄糖消耗速率明顯高于厭氧條件下葡萄糖消耗速率。然而，在該時間段，比葡萄糖消耗速率相差不大，達到2.2 g葡萄糖/(g細胞·L·h)左右。發酵12 h后，比葡萄糖消耗速率出現逐漸下降趨勢，但厭氧條件下比葡萄糖消耗速率遠遠高于通氣條件下比葡萄糖消耗速率。說明通氣條件使單位質量的酵母細胞消耗葡萄糖的能力降低。

圖5 不同通氣量條件下葡萄糖消耗速率發酵過程曲線Fig.5 Profiles of glucose uptake rate during the fermentation process under different aeration rates

圖6 不同通氣量條件下比葡萄糖消耗速率發酵過程曲線Fig.6 Profiles of specific glucose uptake rate during the fermentation process under different aeration rates

2.3 不同通氣量條件對乙醇生成的影響

對于乙醇的生成，見圖7，在厭氧條件下乙醇產量最高(124.8 g/L)，增加通氣量乙醇產量反而降低。分析葡萄糖消耗與乙醇生成之間的關系，發現乙醇生成速率與葡萄糖消耗速率總體趨勢基本一致，見圖8。發酵6～12 h時間段，乙醇生成速率達到最大值，通氣條件下乙醇生成速率明顯高于厭氧條件下乙醇生成速率。然而，當通氣量在0，40 mL/min時，酵母細胞生成乙醇受到延滯。尤其是當通氣量為40 mL/min時，延滯作用非常明顯，完全消耗葡萄糖所需的時間為30 h，完全生成乙醇所需的時間為36 h。這可能是因為40 mL/min的通氣量不足以維持酵母細胞正常代謝。有研究表明，在缺氧環境中，酵母細胞內會積累大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS是指氧的某些衍生物如超氧負離子、羥自由基和過氧化氫等，過量的ROS能夠使生物大分子如DNA、蛋白質、脂類發生過氧化鏈式反應，造成細胞結構的損傷，影響生理活性［11］。

圖7 不同通氣量條件下乙醇發酵過程曲線Fig.7 Profiles of ethanol production during the fermentation process under different aeration rates

乙醇生成速率與酵母細胞量有直接的關系，為了更深入地了解不同通氣量條件對乙醇生成的影響，計算發酵過程中比乙醇生成速率［g乙醇/(g細胞·L·h)］，見圖9。由圖8可知，發酵6～12 h時間段，乙醇生成速率達到最大值，并且通氣條件下乙醇生成速率明顯高于厭氧條件下乙醇生成速率。然而，厭氧條件下比乙醇生成速率最大，達到1.05 g乙醇/(g細胞·L·h)左右。發酵12 h后，比乙醇生成速率出現逐漸下降趨勢，但厭氧條件下比乙醇生成速率遠遠高于通氣條件下比乙醇生成速率。說明通氣條件使單位質量的酵母細胞生成乙醇的能力降低［12］。

圖8 不同通氣量條件下乙醇生成速率發酵過程曲線Fig.8 Profiles of ethanol production rate during the fermentation process under different aeration rates

圖9 不同通氣量條件下比乙醇生成速率發酵過程曲線Fig.9 Profiles of specific ethanol production rate during the fermentation process under different aeration rates

2.4 不同通氣量條件下的乙醇發酵參數

表3顯示了不同通氣量條件下的乙醇發酵參數。可見，隨著通氣量的增加，發酵時間明顯縮短，而酵母細胞量和酵母細胞產率呈現逐漸增加趨勢。但是，終點乙醇濃度和乙醇產率呈現不斷降低趨勢，另外，發酵強度呈現先升高后降低的趨勢。從中可以說明發酵過程中通入適量氧有助于縮短發酵時間，提高發酵強度，但過量通氣可能會導致酵母大量繁殖，或者進行好氧發酵生成CO2和H2O，從而降低乙醇產率和發酵效率。

3 討論與小結

本文研究了在260 g/L葡萄糖為底物的高濃度乙醇發酵過程中，不同通氣量條件對酵母細胞生長，葡萄糖消耗和乙醇生成等參數的影響。研究表明，不同通氣量條件下，酵母細胞的生成與葡萄糖的消耗以及乙醇的生成三者關系密切，三者彼此影響和作用。在通氣條件下，酵母細胞得以大量繁殖，酵母細胞存活率高并且乙醇耐受能力強。從而大量葡萄糖被酵母用于自身的生長繁殖和脂類物質的生成，影響乙醇的產量。由表3可以看出酵母細胞產率隨通氣量的增大而增大，此結果與Alfenore［7］研究一致。不同通氣量條件下，酵母細胞間的差異性直接影響葡萄糖的消耗和乙醇的生成。與厭氧條件相比，大大縮短了發酵時間，以及提高了發酵強度。然而，在通氣條件下，乙醇產量降低并且單位質量的酵母細胞消耗葡萄糖和生成乙醇的能力也降低。Ghaly等［13］以乳糖為底物，利用假絲酵母進行酒精發酵，發現最適的微通氧速率和初糖濃度分別為0.1 vvm和150 g/L。如果提高通氧速率，更多的底物被用于酵母細胞的增殖，導致乙醇的產量降低。孜力汗等［14］研究發現，增大通氣量同樣會使乙醇產量降低。因為在此狀態下，生物量、甘油生成和乙醇夾帶損失皆為最高，嚴重分流了碳原子流向乙醇。對于單位質量的酵母細胞消耗葡萄糖和生成乙醇的能力降低情況，有學者分析如下［15］，糖酵解過程中，磷酸果糖激酶(PFK)催化生成的FDP(1，6-二磷酸果糖)很容易被分解，使得菌體內的FDP含量降低，從而使PFK的活性降低。PFK又受ATP反饋抑制和檸檬酸的抑制，檸檬酸是TCA循環的成員之一，伴隨糖代謝的進行，細胞內檸檬酸的量在通氣條件下比厭氧條件下要多。因此伴隨PFK活性降低，6-磷酸果糖積累，而且因己糖異構酶的活性升高，使6-磷酸葡萄糖糖在細胞內積累的量增多，其結果使得催化葡萄糖磷酸化的磷酸己糖酶(HK)活性降低，故使得葡萄糖的消耗受到抑制。此外，在通氣條件下，發酵所必須的NADH轉人線粒體，并在線粒體內進行氧化，供給細胞生長所需的能量，從而因細胞質內的NADH缺少，使得乙醇脫氫酶(ADH)不起作用，故使生成乙醇的能力降低。

表3 不同通氣量條件下的乙醇發酵參數Table 3 Effect of aeration on fermentation parameters

Lin等［9］研究發現，以葡萄糖為底物的高濃度乙醇發酵過程中，選擇以對數期進行通氣(0.82 L/min)。Chang等［16］研究發現，結合有氧和厭氧進行補料分批發酵，可以既提高微生物的生長量又達到高乙醇產量。在初始通氧階段，將葡萄糖濃度維持在一個較低水平進行酵母的大量增殖;在厭氧階段，將葡萄糖濃度補充到一個較高的水平進行高濃度乙醇發酵。從而消除發酵后期通氣對酵母細胞代謝的影響。

因此，通入適當的空氣是高濃度乙醇發酵的一個重要控制參數，能夠縮短發酵時間，增加酵母細胞量，提高酵母細胞的活性和乙醇耐受性。然而，乙醇產量與單位質量的酵母細胞消耗葡萄糖和生成乙醇的能力降低。綜合考慮，本文最適通氣量為80 mL/min，終點乙醇濃度為117.9 g/L，發酵強度為3.93 g/(L·h)，乙醇產率為0.452 g/g(發酵效率87.8%)。

［1］ Elena P，Gabriela R，Traian H.Current approaches to efficient biotechnological production of ethanol［J］.Innovative Romanian Food Biotechnology，2009，4:1-11.

［2］ Dewey D Y Ryu，Y J Kim，J H Kim.Effect of air supplement on the performance of continuous ethanol fermentation system［J］.Biotechnology and Bioengineering，1984，26(1):12-16.

［3］ 何向飛，張梁，石貴陽.利用溶氧控制策略進行高密度和高強度乙醇發酵的初步研究［J］.食品與發酵工業，2008，34(1):20-23.

［4］ Caroline F-B，Veronique D，Eric R，et al.Oxygen addition and sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae during enological fermentation［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，93(2):176-182.

［5］ Hyeon Beom Seo，Ji Hyeon Yeon，Myung Hoon Jeong，et al.Aeration alleviates ethanol inhibition and glycerol production during fed-batch ethanol fermentation［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2009，14(5):599-605.

［6］ Keisuke Nagahisa，Toshiharu Nakajima，Katsunori Yoshikawa，et al.DNA microarray analysis on Saccharomyces cerevisiae under high carbon dioxide concentration in fermentation process［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2005，10(5):451-461.

［7］ Alfenore S，Cameleyre X，Benbadis L，et al.Aeration strategy:a need for very high ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，63(5):537-542.

［8］ F NoeArroyo-Lopez，AmparoQuerol，EladioBarrio.Application of a substrate inhibition model to estimate the effect of fructose concentration on the growth of diverse Saccharomyces cerevisiae strains［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2009，36(5):663-669.

［9］ Yen Han Lin，Wan ShanChien，Kow-Jen Duan，et al.Effect of aeration timing and interval during very-high-gravity ethanol fermentation［J］.Process Biochemistry，2011，46(4):1 025-1 028.

［10］ 左松，伍時華，張健，等.不同時間添加氮源對酵母GJ2008果糖與葡萄糖利用的影響［J］.食品與發酵工業，2014，40(4):18-22.

［11］ Wolff SP，Garner A，Dean R T.Free radicals，lipids and protein degradation［J］.Trends in Biochemical Sciences，1986，11(1):27-31.

［12］ Hyeon Beom Seo，Seung Seop Kim，Hyeon Yogn Lee，et al.High-level production of ethanol during fed-batch ethanol fermentation with a controlled aeration rate and nonsterile glucose powder feeding of Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2009，14(5):591-598.

［13］ Ghaly A E，AAEI-Taweel.Effect of micro-aeration on the growth of Candida Pseudotropicalis and production of ethanol during batch fermentation of cheese whey［J］.Bioresource Technology，1995，52(3):203-217.

［14］ 孜力汗，劉晨光，王娜，等.多種通氣策略下的高濃度乙醇生產［J］.中國生物工程雜志，2013，33(6):86-92.

［15］ 管斌，馬美范，王鴻棋，等.部分通氧對酒精連續發酵的影響［J］.中國釀造，1999(2):22-24.

［16］ Der Ming Chang，Tzu Hsing Wang，Lung Chien，et al.Improved operating policy utilizing aerobic operation for fermentation process to produce bio-ethanol［J］.Biochemical Engineering Journal，2012，68:178-189.