重組蔗糖異構(gòu)酶的制備及應(yīng)用條件優(yōu)化*

程勝，段緒果，吳敬

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

異麥芽酮糖(isomaltulose)，又稱帕拉金糖，是蔗糖的同分異構(gòu)體，是一種功能性二糖，與蔗糖有著相似的物理性質(zhì)和口感［1-3］。不同于蔗糖，異麥芽酮糖作為一種新型甜味劑，它具有甜度低、非致齲齒性［4］，被人體食用后，在血液中釋放單糖的速度緩慢且不刺激胰島素的分泌，因而有益于糖尿病的防治并可防止脂肪過多的積累，適合糖尿病和肥胖人群食用［5］。與蔗糖相比，異麥芽酮糖具有良好的酸穩(wěn)定性、極低的吸濕性和無毒性，非常適合在食品上應(yīng)用。與蔗糖不同的是，異麥芽酮糖作為一種還原糖，可以作為前體繼續(xù)加氫生成異麥芽酮糖醇，相比于異麥芽酮糖，異麥芽酮糖醇有著更優(yōu)良的性質(zhì)，是一種新型的功能性食用糖醇，更是一種最理想的代糖品［6-7］。

蔗糖異構(gòu)酶(EC 5.4.99.11)，也稱異麥芽酮糖合酶，是生物法轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖最合適的酶，該酶轉(zhuǎn)化蔗糖的主產(chǎn)物是異麥芽酮糖，同時轉(zhuǎn)化過程中伴隨少量單糖(葡萄糖和果糖)的生成［8-14］。1995年，Ralf等人首次將來源于 Protaminobacter rubrum CBS 547.77的蔗糖異構(gòu)酶在E.coli中進行了成功的表達［15］;2010年，Park等實現(xiàn)了Enterobacter sp.的蔗糖異構(gòu)酶編碼基因在Lactococcus lactisMG1363中異源表達，并實現(xiàn)該酶的胞外分泌［16］;Lee等在2011年將來源于 Enterobacter sp.的蔗糖異構(gòu)酶在Saccharomyces cerevisiae EBY100進行成功的表達，并且實現(xiàn)此酶在酵母細胞的表面展示［17］。異麥芽酮糖的生產(chǎn)目前主要有3種方法:單酶轉(zhuǎn)化、游離細胞轉(zhuǎn)化和固定化細胞［13-14，18-20］。1999年，Veronese等［13］用來源于 Serratia plymuthica ATCC 15928蔗糖異構(gòu)酶，以10%蔗糖為底物，轉(zhuǎn)化5 h，異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率為 72.6%。Amornrat［12］以20%蔗糖為底物，用Klebsiella pneumoniae NK33-98-8來源的蔗糖異構(gòu)酶進行催化，最終異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率為76.8%。Lee等［21］以20%蔗糖為底物，用Protaminobacter rubrum CBS 547.77來源的蔗糖異構(gòu)酶進行催化，得到異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率為88.5%。Cha等［14］將來源于Enterobacter sp.FMB-1蔗糖異構(gòu)酶在E.coli里進行表達，利用游離細胞進行催化，以6%蔗糖為底物，轉(zhuǎn)化16 h，異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率為78%。

本研究將前期構(gòu)建的表達質(zhì)粒pET-24a/palI轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL(DE3)，構(gòu)建得到產(chǎn)重組Serratia plymuthica AS9蔗糖異構(gòu)酶的重組菌株。在搖瓶和3 L發(fā)酵罐條件下對重組菌產(chǎn)酶情況進行初步考察基礎(chǔ)上，對轉(zhuǎn)化工藝進行優(yōu)化，以獲得高效生產(chǎn)異麥芽酮糖的最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(Escherichia coliBL21(DE3))和重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a-palI為本實驗室保藏［22］。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，卡那霉素的終濃度為30 μg/mL。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2hpo412.54，KH2PO42.31，甘氨酸 0.75%，卡那霉素終濃度為30 μg/mL。

3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油8，工業(yè)蛋白胨1，工業(yè)酵母粉 2，檸檬酸 1.7，(NH4)2HPO44.0，KH2PO413.5，MgSO4·7H2O 1.39，微量元素液 10 mL，調(diào) pH 到7.0

微量元素液 (g/L):FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22.0，(NH4)6Mo7O240.1。

補料液 (g/L):甘油 500，MgSO4·7H2O 15，工業(yè)級酵母粉4，工業(yè)級蛋白胨1.0。

1.1.3 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒購于天根生化科技有限公司;卡那霉素購自上海生工生物有限公司;蛋白電泳試劑和蛋白分子質(zhì)量標準購自南通碧云天技術(shù)研究所;酵母粉、蛋白胨購自O(shè)xoid(英國)公司;異麥芽酮糖、海藻酮糖標樣購自Sigma公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器

凝膠成像儀、蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司;Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;細胞破碎儀，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;3 LInfors全自動發(fā)酵罐，伊孚森生物技術(shù)有限公司(中國)。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶

種子培養(yǎng):從-80℃保存的甘油管接2%菌液至LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min，培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)基使用前添加30 μg/mL卡那霉素。

搖瓶發(fā)酵:將種子液以5%的接種量接入添加了30 μg/mL卡那霉素的TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600約為1.5 h，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG同時降溫至25℃進行誘導(dǎo)，在200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后離心收集發(fā)酵上清液，即為蔗糖異構(gòu)酶粗酶液。

超聲破壁:用50 mmol/L，pH 7.0的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液將細胞沉淀復(fù)溶到OD600為5，用超聲波細胞破碎儀進行破壁處理，離心收集破壁上清檢測蔗糖異構(gòu)酶胞內(nèi)表達情況。

1.2.2 重組菌在3 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵培養(yǎng)

從-80℃保藏的甘油管中以2%的接種量將種子接種于含有30 μg/mL卡那霉素的工業(yè)級LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)8～10 h。將種子液以8%的接種量接入3 L Infors全自動發(fā)酵罐中，初始裝液量為1.2 L，初始pH為7.0，初始溶氧校為100%，30 μg/mL的卡那霉素以1.5 mL/L加入發(fā)酵罐中，初始轉(zhuǎn)速設(shè)為200 r/min。33℃恒溫發(fā)酵，控制轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián)，維持溶氧水平在30%左右，用25%氨水控制pH 7.0左右。初始培養(yǎng)基中甘油耗盡后，溶氧開始反彈，將補料液按照比生長速率μ=0.2 h-1進行指數(shù)流加。同時每隔12 h加1次滅過菌的30 μg/mL的卡那霉素;當(dāng)DCW為15 g/L，接入10 g/L甘氨酸;當(dāng)DCW為50 g/L，恒速0.4 g/(L·h)流加10%的乳糖進行誘導(dǎo)，補料液流量梯度遞減，整個發(fā)酵過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.2.3 蔗糖異構(gòu)酶酶活測定方法

將100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到900 μL含有蔗糖的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 6.0)中，使蔗糖的終質(zhì)量濃度為100 g/L。振蕩混勻后置30℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，滅酶，離心。反應(yīng)樣品中蔗糖、異麥芽酮糖、海藻酮糖、葡萄糖和果糖的含量利用HPLC進行檢測，檢測器為示差檢測器。

酶活單位定義:在上述條件下，每分鐘釋放1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.4 酶轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖的反應(yīng)條件優(yōu)化

1.2.4.1 pH值對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

配制pH 4.0～8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，以20%的蔗糖為底物，分別溶解于不同pH的緩沖液，加酶量為1 g蔗糖加酶15 U，置于30℃，150 r/min的水浴搖床，轉(zhuǎn)化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.4.2 溫度對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

以20%的蔗糖為底物，加酶量為15 U/g，反應(yīng)初始 pH 6.5，分別在20、25、30、35、40 和45 ℃水浴搖床轉(zhuǎn)化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.4.3 加酶量對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

以20%蔗糖為底物，反應(yīng)初始pH 6.5，加酶量分別為5、10、15、20、25 和 30 U/g，置于 30 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴搖床，轉(zhuǎn)化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.4.4 反應(yīng)時間對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

以20%的蔗糖為底物，加酶量為20 U/g，初始pH 6.5，置于30℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴搖床，每2 h取樣500 μL，HPLC檢測異麥芽酮糖的生產(chǎn)量。

1.2.4.5 底物濃度對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖的影響

分別配制10%、20%、30%、40%和50%的蔗糖，加酶量為20 U/g，初始 pH 6.5，置于30℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴搖床，轉(zhuǎn)化8 h，HPLC檢測異麥芽酮糖生成量。

1.2.5 HPLC檢測含量

轉(zhuǎn)化后的樣品經(jīng)過加熱滅酶后，12 000 r/min離心10 min，取上清用去離子水適當(dāng)稀釋，備用。HPLC檢測色譜條件是:Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱4.6 mm×250 mm 5 μm Syncronis Amino Column;Aginent示差檢測器;流動相為V(乙腈)∶V(水)=80∶20，流速為 0.8 mL/min;柱溫30℃。

2 結(jié)果

2.1 重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-24a-palI產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶

2.1.1 重組蔗糖異構(gòu)酶的表達及搖瓶產(chǎn)酶曲線

從-80℃保藏的甘油管中以2%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8～10 h。轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，于25℃進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后每隔3 h取樣測酶活，結(jié)果如圖1所示。

圖1 重組菌在TB培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Sucrose isomerase production by E.coli in TB medium

誘導(dǎo)前24 h胞外酶活以較快的速度增加。誘導(dǎo)24 h時，離心取得上清即為粗酶液。菌體沉淀用緩沖液懸浮均勻，超聲破碎儀進行細胞破碎，離心取得胞內(nèi)上清。酶活測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵24 h胞外酶活達到最大值為253.1 U/mL，胞內(nèi)上清酶活為110.2 U/mL。SDS-PAGE電泳(圖2)顯示，在65 kDa處有目的蛋白條帶，與理論的蔗糖異構(gòu)酶分子質(zhì)量相符合，表明蔗糖異構(gòu)酶在E.coli BL(DE3)中成功表達。

圖2 蔗糖異構(gòu)酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the sucrose isomerase

2.1.2 3 L罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶

重組菌3 L發(fā)酵罐條件為:發(fā)酵溫度33℃，pH 7.0，溶氧水平控制在30%左右，當(dāng)溶氧迅速反彈時，開始以指數(shù)流加方式添加補料液。當(dāng)DCW為15 g/L，開始加入乳糖誘導(dǎo)，實驗中，在其他條件不變下流加乳糖濃度分別為 0.2、0.4、0.8 g/(L·h)，誘導(dǎo)發(fā)酵33 h。結(jié)果如圖3所示。

重組菌的胞外酶活如圖3所示，其中在0.4 g/(L·h)乳糖誘導(dǎo)濃度下，當(dāng)誘導(dǎo)30 h時胞外酶活和總酶活均是最高，胞外酶活為654 U/mL，分別是0.2和0.8 g/(L·h)誘導(dǎo)濃度下的1.52和1.43倍;總酶活為1 012 U/mL，分別是0.2和0.8 g/(L·h)誘導(dǎo)濃度下的1.12和1.23倍。此時蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活占總酶活的61.6%。因此，乳糖的誘導(dǎo)濃度應(yīng)該選擇0.4 g/(L·h)。同時，雖然不同乳糖濃度誘導(dǎo)下酶活力不同，但是其中它們的胞內(nèi)酶活在誘導(dǎo)18 h均能達到最大值，隨著誘導(dǎo)時間的延長，胞內(nèi)酶活不斷分泌到胞外，使得胞內(nèi)酶活力逐漸下降，而胞外上清酶活繼續(xù)增大，當(dāng)誘導(dǎo)30 h，重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的胞外酶活均能達到最大值。與搖瓶酶活力相比，重組蔗糖異構(gòu)酶在3 L罐中最高胞外酶活是搖瓶酶活力的2.58倍。

圖3 重組菌3 L罐產(chǎn)酶過程Fig.3 Sucrose isomerase production by E.coli in 3 liter fermentor

本實驗的研究結(jié)果認為重組蔗糖異構(gòu)酶的乳糖誘導(dǎo)濃度不是越高越好，濃度過高可能會導(dǎo)致蛋白合成速度過快，使得包涵體積累，導(dǎo)致總酶活下降，影響酶的胞外分泌效果。在0.4 g/(L·h)乳糖誘導(dǎo)濃度下，蛋白的表達與分泌得到了較好的協(xié)調(diào)與統(tǒng)一，因而胞外酶活較其他誘導(dǎo)濃度有較大的提高。

2.2 重組蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH的影響

如圖4所示，當(dāng)pH為6.5時，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率最高，達到82.5%。當(dāng)pH為4.0時，異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率最低僅為2%。pH在5.5～7.5時，異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率均高于75%，pH為8.0時，轉(zhuǎn)化率又下降到54.2%，說明了pH中性條件適合酶的轉(zhuǎn)化，偏酸偏堿都不利于異麥芽酮糖的生成。從酶反應(yīng)動力學(xué)的角度分析，pH的影響可能是因為它改變了酶活性部位有關(guān)基因的解離狀態(tài)。在最適pH值時，酶活性部位基團解離狀態(tài)最適合于酶分子對底物的催化，酶活力高，因此蔗糖轉(zhuǎn)化率最高;而高于或低于最適pH值時，酶分子上活性基團的解離狀態(tài)不利于酶對底物分子的催化，酶活力下降。因此反應(yīng)最適pH選為6.5。

圖4 初始pH蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of initial pH on the enzymatic conversion

2.2.2 反應(yīng)溫度的影響

如圖5所示，30℃下，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率達到最大值82.5%。同時，隨著溫度的升高或者下降，異麥芽酮糖含量下降，但是單糖含量(葡萄糖和果糖)由6.2%升高至16.5%(數(shù)據(jù)未展示)。ZHANG等［10］研究來源于Klebsiella sp.LX3蔗糖異構(gòu)酶發(fā)現(xiàn)，溫度可以影響酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)產(chǎn)物的比例，較高的溫度有利于生成單糖;WU等［9］年報道稱來源于Klebsiella planticola蔗糖異構(gòu)酶在轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖時，當(dāng)溫度低于30℃，溫度的降低有利于海藻酮糖的生成。蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖生成異麥芽酮糖的過程，同時包含兩個過程，水解反應(yīng)和異構(gòu)反應(yīng)。水解反應(yīng)主要是水解蔗糖生成葡萄糖和果糖;異構(gòu)反應(yīng)主要是蔗糖中兩種單糖連接的糖苷鍵發(fā)生轉(zhuǎn)換，異構(gòu)生成異麥芽酮糖和海藻酮糖兩種同分異構(gòu)體。當(dāng)溫度升高時，反應(yīng)有利于水解過程，故單糖量釋放增加。而當(dāng)溫度較低時，反應(yīng)雖然有利于異構(gòu)過程，但此時酶的構(gòu)象更有利于生成海藻酮糖。故本實驗選用30℃作為最適反應(yīng)溫度。

圖5 反應(yīng)溫度對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzymatic conversion

2.2.3 加酶量的影響

如圖6所示，隨著加酶量的增多，異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率也在不斷地增加，當(dāng)加酶量為20 U/g時，轉(zhuǎn)化達到最大86.9%。之后，隨著加酶量的增加，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率稍微降低，而單糖含量有所增加。如2.2.2所述，蔗糖異構(gòu)酶催化過程包括兩個反應(yīng):水解反應(yīng)和異構(gòu)反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)體系中加酶量超過20 U/g時，可能會稍微增強水解反應(yīng)的進行，從而有利于釋放單糖。所以，20 U/g的加酶量是蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖過程中最優(yōu)加酶量。

圖6 加酶量對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on the enzymatic conversion

2.2.4 反應(yīng)時間的影響

如圖7所示，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率也隨之提高，轉(zhuǎn)化8 h時，轉(zhuǎn)化率達到最大值86.9%，之后，隨著時間的延長，轉(zhuǎn)化率基本不變。蔗糖異構(gòu)酶在轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖的過程中，在起始的3 h內(nèi)酶催化反應(yīng)速率是整個反應(yīng)過程中的最大值。3 h時轉(zhuǎn)化率即可達到66.9%。在3～8 h內(nèi)，催化反應(yīng)速率逐漸減小，異麥芽酮糖的產(chǎn)生量在8 h達到最大值。因此，最佳轉(zhuǎn)化時間可以選擇為8 h。

圖7 反應(yīng)時間對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of transform time on the enzymatic conversion

2.2.5 底物濃度的影響

如圖8所示，當(dāng)蔗糖底物濃度為400 g/L時，轉(zhuǎn)化率可以達到87.9%。蔗糖濃度低于400 g/L時，異麥芽酮糖的生產(chǎn)量隨著底物濃度的增加小幅度增加。而500 g/L蔗糖為底物時，不僅轉(zhuǎn)化率下降到83.2%，同時轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)，在此濃度下，體系在反應(yīng)后期出現(xiàn)了少數(shù)懸浮的球狀小體，推測可能是在高濃度的蔗糖濃度下，體系水活力較低，加之蔗糖異構(gòu)酶本身不穩(wěn)定，所以出現(xiàn)了少數(shù)的蛋白質(zhì)聚集。因此，400 g/L濃度的蔗糖是最合適的。

圖8 底物濃度對蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.8 Effect of substrates concentration on the enzymatic conversion

3 討論

早在 1983 年，F(xiàn)ujii等［23］從 Serratia plymuthica NCIB 8285中分離得到蔗糖異構(gòu)酶，之后通過固定化細胞轉(zhuǎn)化蔗糖，生成的產(chǎn)物包括異麥芽酮糖、海藻酮糖、葡萄糖和果糖，此外還有極少量的異松三糖生成。1999 年，Veronese 等［13］從 Serratia plymuthica ATCC 15928得到蔗糖異構(gòu)酶，并對該酶進行純化，對得到的純酶進行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究。進一步通過實驗證明了在蔗糖轉(zhuǎn)化異麥芽酮糖過程中葡萄糖是蔗糖的競爭性底物，同時提出溫度可能是影響酶催化反應(yīng)的關(guān)鍵因素。南京工業(yè)大學(xué)任賁等人［24］在E.coli克隆表達來源于Erwinia rhapontici NX-5的蔗糖異構(gòu)酶，對重組菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件及誘導(dǎo)劑進行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，蔗糖異構(gòu)酶的最大酶活為14.72 U/mL。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究在E.coli BL21(DE3)中成功表達了來源于Serratia plymuthica AS9的蔗糖異構(gòu)酶基因(palI)，重組菌搖瓶發(fā)酵胞外酶活為253.1 U/mL。3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵初步研究得到胞外最大酶活654 U/mL，也是目前文獻報道的最高酶活。下一步研究重點是將該重組菌在3 L發(fā)酵罐中進行優(yōu)化，獲得更高表達量的蔗糖異構(gòu)酶酶液。

國內(nèi)南京工業(yè)大學(xué)李莎等［11］在大腸桿菌中克隆表達來源于Erwinia rhapontici NX-5的蔗糖異構(gòu)酶，任賁等［25］利用該重組酶轉(zhuǎn)化濃度為55%的蔗糖，可以得到異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率為83%。李莎等［11］之后利用重組菌游離細胞轉(zhuǎn)化55%的蔗糖，最終異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率達到87%。本研究在考察了pH對酶轉(zhuǎn)化的影響的基礎(chǔ)上，對其他的影響條件，如溫度、加酶量、轉(zhuǎn)化時間以及底物濃度等進一步研究，最終把異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率提高到87.9%，同時底物濃度達到40%，是目前文獻報道在400 g/L底物濃度下，單酶轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖的最大轉(zhuǎn)化率。

此外，大部分微生物來源的蔗糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性較差［8-10，12］，最適溫度為30～40 ℃。本研究中的重組蔗糖異構(gòu)酶在50℃下半衰期僅為8 min左右，熱穩(wěn)定性較差。同時蔗糖作為微生物豐富的碳源，低溫下轉(zhuǎn)化過程容易引起其他微生物的生長和消耗蔗糖，不利于酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)進行。因此，在后續(xù)的工作中考慮到利用定點突變來提高蔗糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，進一步滿足工業(yè)上酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)在較高溫度下的連續(xù)進行。

4 結(jié)論

本研究中重組E.coli BL(DE23)/pET-24a-palI菌株能夠高效分泌表達蔗糖異構(gòu)酶，搖瓶發(fā)酵初步研究得到胞外上清酶活253.1 U/mL，3L發(fā)酵罐中在0.4 g/(L·h)乳糖誘導(dǎo)濃度下高密度發(fā)酵得到發(fā)酵上清的最大酶活可達到654 U/mL。對該重組蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生成異麥芽酮糖酶法轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)條件為底物濃度為400 g/L，反應(yīng)初始pH 6.5，溫度30℃，加酶量20 U/g，轉(zhuǎn)化時間8 h，異麥芽酮糖可以達到最大轉(zhuǎn)化率87.9%。

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