南海鳶烏賊肌原纖維蛋白的熱穩定性研究*

馬靜蓉，楊賢慶，馬海霞，陳勝軍，黃卉

1(廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江，524088)

2(中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東廣州510300)

鳶烏賊(Symplectoteuthis oualaniensis)屬于鞘亞綱，槍形目，柔魚科，其生命周期短、生長率高、繁殖力強，是一種極具開發潛力的頭足類資源。其資源豐富，在印度洋、太平洋的赤道和亞熱帶海域廣泛分布，其中分布在南海和印度洋西北部海域的數量較大，據報道其可食部分高達80%以上，較其他已開發的頭足類動物都高［1］。

隨著傳統漁業資源的衰退以及我國遠洋漁業的飛速發展，我國南海豐富的鳶烏賊資源被開發，其高值化加工利用成為了當前的熱點問題。南海鳶烏賊高蛋白低脂肪，能滿足人們對海洋蛋白的需求;含有豐富的氨基酸，肉美味鮮;豐富的DHA、EPA及鋅鐵元素，具備一定的保健功效［2］。目前國內外學者研究較多的頭足類加工主要是墨魚、秘魯魷魚、阿根廷魷魚、太平洋褶柔魚等，對其肌肉的加工產品主要有魷魚絲、魷魚粒、燒烤類以及更高值化的魚糜制品，而對鳶烏賊特別是南海鳶烏賊胴體肌肉的加工研究卻鮮見報道，用鳶烏賊胴體肌肉來制備冷凍魚糜及相關的魚糜制品，不失為其高值化利用的一條可行途徑。

魚糜，是一種新型的水產調理食品原料，其主要成分是肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白是水產品加工中主要的利用對象，是以肌球蛋白和肌動蛋白為主體組成的可支撐肌肉運動的結構蛋白質，具有重要生物學功能，其在魷魚等頭足類動物中所占比例高達75% ～85%［3］，除了參與肌肉的收縮外，還與肉制品的流變學特性如保水性、黏結性、質地、彈性等有著密切的關系，其熱誘導凝膠對肉制品的結構特性起主要作用［4］。了解鳶烏賊肌肉性質及其肌原纖維蛋白的基本性質是利用鳶烏賊胴體肌肉制作魚糜的首要前提，因此，本文以南海鳶烏賊為研究對象，研究了其胴體肌肉的基本特性，并重點探索了溫度對其肌原纖維蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳶烏賊，來源于南海水產研究所“南鋒號”科考船，捕撈于南海海域，-20℃凍藏保存;NaCl，分析純，廣州化學試劑廠;三氯乙酸，分析純，天津市大茂化學試劑廠;NaH2PO4，分析純，天津市福晨化學試劑廠;Tris，分析純，天津市福晨化學試劑廠;R-250，分析純，廣州化學試劑廠;Triton X-100，分析純，廣州市博理生物科技有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，康為世紀生物科技有限公司;考馬斯亮藍R-250，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultra Turrax T50均質機(德國IKA公司);Sigma-3K30高速冷凍離心機(德國SIGMA公司);PB-10型精密pH計(Sartorius公司);3-550A高溫馬弗爐(美國NeyVULCAN公司);Kjeltec2300全自動定氮分析儀(瑞士foss公司);DW-86L626超低溫冷柜(青島海爾特種電器有限公司);Powerpac@HV等電聚焦電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 一般成分的測定

水分測定:常壓105℃烘干至恒重(GB/T9695.15-2008);粗蛋白測定:凱氏定氮法(GB/T50095-2010);粗脂肪測定:索氏抽提法(GB/T14772-2008);灰分測定:高溫灼燒灰化法(GB/T9695.18-2008);總揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定:蒸餾法(SC/T 3032-2007);pH的測定:pH測定儀。

1.3.2 胴體肌肉各種蛋白質成分的分離及測定

鳶烏賊胴體肌肉各種蛋白的分離方法參照Hashimoto［5］的方法進行。分離出的肌漿蛋白、肌基質蛋白、肌原纖維蛋白、堿溶性蛋白及非蛋白氮均采用全自動凱氏定氮儀測定其含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白質的提取［6］

取10 g碎肉加6倍的 A液(pH=7.5，0.1 M KCl，20 mmol/L Tris-HCI緩沖液)和2倍的B液(1%Triton，pH=7.5，0.1 mol/L KCl，20 mol/L Tris-HCI緩沖液)，用 IKA 勻漿機勻漿(9 600 r/min、30 s、5次)，紗布過濾，除去結締組織。再用冷凍離心機離心(4℃、8 000 r/min、15 min)，去上清液，沉淀用 8 倍的A液混合均勻離心，重復3次。最后用A液將沉淀稀釋至300 mL，即得到肌原纖維蛋白溶液，用考馬斯亮藍法測定其濃度，為避免反復凍融，將其分裝于10 mL的離心管中，貯存于-70℃超低溫冰箱中備用。

1.3.4 肌原纖維蛋白溫浴處理方法

取8 mL肌原纖維蛋白溶液于10 mL離心管中，在不同溫度下進行保溫反應，按照實驗設計的要求，取出各溫浴時間下的樣液進行測定分析。

1.3.5 不同溫度下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化

將溫浴處理后的樣品與5X的凝膠上樣緩沖液以4∶1的比例混合，煮沸10 min，放置于4℃冰箱中備用。電泳采用5%濃縮膠，10%分離膠，初始電壓80 V，當樣品進入分離膠后，將電壓增大至120 V，當溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm處，關閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍R-250染色。

2 結果與分析

2.1 鳶烏賊胴體肌肉一般成分分析

南海鳶烏賊胴體肌肉中，粗蛋白的含量為19.17%，粗脂肪含量僅為0.58%(表1)，高蛋白低脂肪，能夠很好地滿足現代人的膳食需求，為消費者提供優質的海洋蛋白。由于高濃度的非蛋白氮存在，比如揮發性鹽基氮(VBN)和三甲胺(TMA)，使得一些頭足類動物肌肉具有強烈的氨臭味，秘魯魷魚肌肉中VBN 含量最高可達 247 mg/100 g［6］，新鮮的印度洋鳶烏賊 VBN 含量為 193.7 mg/100 g［7］，然而，本實驗中的南海鳶烏賊的氣味較溫和，測定其VBN含量為53.2 mg/100 g，但仍高于國標規定的30 mg/100 g，加工時應適當清洗降低其含量。pH值在6.4～6.8之間，無怪酸味，適合用作食品加工。

表1 南海鳶烏賊胴體肌肉基本營養成分%Table 1 Proximate composition of the mantle muscles from Ryukyu squid in South China Sea%

2.2 鳶烏賊胴體肌肉蛋白的組成

Chu等［8］研究了阿根廷魷魚、赤魷、烏賊、章魚等幾種頭足類動物的胴體肌肉蛋白組成，研究發現其含有的肌原纖維蛋白為50% ～55%。由表2可知，鳶烏賊胴體肌肉中肌原纖維蛋白含量所占比例較高，對鳶烏賊的加工性質，如凝膠性起著關鍵的作用，因此，可將南海鳶烏賊加工成魚糜及魚糜制品。鳶烏賊的肌漿蛋白含量較少，這對其持水性有影響，使得持水能力相對較弱，在以后的加工中應研究提高其持水性的方法。

表2 南海鳶烏賊胴體蛋白質構成%Table 2 Protein composition of the mantle muscles from Ryukyu squid in South China Sea%

2.3 鳶烏賊肌原纖維蛋白在不同溫度下SDSPAGE的變化

鳶烏賊屬于頭足類動物，其肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動蛋白(Actin)、軟體動物所特有的副肌球蛋白(PM)以及相對分子質量更小的原肌球蛋白等［9］。如圖1～圖6，SDS-PAGE結果顯示南海鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC分子質量大于245 kDa、PM的分子質量在100 kDa左右、Actin分子質量接近48 kDa。此外，還能看見重酶解肌球蛋白(HMM)和輕酶解肌球蛋白(LMM)，HMM和LMM的存在，顯示MHC發生了水解作用，可能是由于存在蛋白水解酶，使得MHC發生了分解。對比參考文獻［6，10］，可以發現鳶烏賊肌原纖維蛋白的 MHC分子質量較大，所含有的PM所占的比例較阿根廷魷魚、秘魯魷魚等大，研究表明PM對魷魚等頭足類動物的蛋白質穩定性、凝膠強度等性質有很大影響［12-13］，南海鳶烏賊肌肉蛋白中PM所占比例較大，可能會使得其肌肉的性質相比于其他頭足類動物略有差異。

肌原纖維蛋白隨著溫度的升高、溫浴時間的延長，其SDS-PAGE會發生明顯變化，MHC、PM、Actin會有不同程度的降解，且不同溫度下降解的速度不同。

由圖1所示，在4℃條件下，雖然由于取樣的誤差導致2 h的條帶較淡，36 h的條帶顏色比較深，但從整體趨勢可以看出，48 h內，鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC、PM、Actin等未有明顯的變化。說明在較低溫度下，鳶烏賊肌原纖維蛋白變化緩慢，在4℃下，至少可以存放2 d。

圖1 4℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.1 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 4℃

25℃時，溫浴1 h后，在分子質量63 kDa處開始出現新的蛋白質條帶，MHC在溫浴12 h后開始發生明顯的降解，24 h后基本上完全降解。PM、Actin以及較小分子質量的原肌球蛋白等，在溫浴12 h后也開始出現明顯的降解，并且隨著溫浴時間的繼續延長，降解程度越來越大(圖2)。對比4℃能看到，溫度的升高對該鳶烏賊肌原纖維蛋白產生了較大的影響。

圖2 25℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.2 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 25℃

當溫度在40℃時，鳶烏賊肌原纖維蛋白的降解較為快速，溫浴0.5 h后，MHC發生了明顯的降解，1.5 h后基本降解完全;0.5 h時在63 kDa處出現了和25℃放置1 h后一樣的蛋白質條帶;1 h時在分子質量25 kDa處，開始出現新的蛋白條帶，且隨著時間的延長越來越明顯;PM、Actin降解并不明顯，可能是由于放置時間較短的原因(圖3)。

魷魚等頭足類動物，肌肉中存在大量蛋白酶，其蛋白水解活性較其他大多數的魚種都高［14］，研究發現這些酶主要是金屬蛋白酶［15-16］，它會選擇性的將肌球蛋白微粒分解成重酶解肌球蛋白(HMM)和輕酶解肌球蛋白(LMM)，從而導致肌肉的加工特性如凝膠性較弱。由SDS-PAGE圖分析結果可知，南海鳶烏賊肌肉中存在這樣的蛋白水解酶，使得MHC發生降解，其活性在40℃時較強。同樣，王進勉等［7］對印度洋鳶烏賊加工特性進行研究，提到印度洋鳶烏賊的肌肉蛋白質中含有一種蛋白酶，這種酶在也是在40℃ 附近有較高活性，會降解肌球蛋白重鏈。因此，為了保持肌原纖維蛋白較完整的功能性，應盡量避免在40℃周圍對南海鳶烏賊進行加工處理。

EDTA具有螯合金屬的作用，食品級EDTA可作為金屬蛋白酶抑制劑，并已經顯示出了能夠明顯抑制魷魚肌肉自溶的能力［17］。Konno等［16］研究發現，導致秘魯魷魚肌肉蛋白自溶的蛋白水解酶主要是金屬蛋白酶，當添加2 mmol EDTA，肌肉蛋白的自溶被顯著性抑制。由圖4可知，40℃時，在添加了1 mmol EDTA可以發現，南海鳶烏賊MHC的降解速度被明顯抑制，在放置了4 h后，仍能看到非常清晰的MHC條帶，進一步證明了，南海鳶烏賊肌肉中的確存在蛋白水解酶，主要是金屬蛋白酶，在后期加工中可以通過添加一定量的EDTA來抑制肌肉蛋白的自溶作用。

圖4 40℃水浴添加1 mmol EDTA條件下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.4 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 40℃with 1 mmol EDTA

從圖5、圖6可以看出，50、60℃溫度下的肌原纖維蛋白，MHC的降解并不明顯，溫浴3～4 h后，仍能看見清晰的MHC蛋白條帶，這種現象和印度洋鳶烏賊尤為相似，王進勉等［7］在研究印度洋鳶烏賊肌原纖維蛋白在不同溫度下的變化中也有提及，表明金屬蛋白酶在高溫下失活;然而，PM、Actin等卻降解得比較快速，可能是由于該溫度是鳶烏賊胴體肌肉中各種內源酶的適宜溫度。研究發現，當溫度為50～70℃時，肌肉中的一些內源性熱穩定性蛋白酶會分解肌球蛋白，在魚糜凝膠的過程中，會導致凝膠劣化現象的發生［18］。因此，如若用鳶烏賊制作魚糜制品，為獲得凝膠質量好的產品，應快速通關此溫度帶。

圖5 50℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.5 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 50℃

圖6 60℃水浴下鳶烏賊肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.6 Changes in SDS of myofibrillar protein from Ryukyu squid during incubation at different time at 60℃

3 結論

南海鳶烏賊是一種優質的水產品，高蛋白，低脂肪，肌原纖維蛋白所占比例達59.63%，其氣味溫和，無怪酸味，為其制作魚糜的加工利用創造了可能。通過對不同溫度下肌原纖維蛋白的SDS-PAGE變化的研究表明，在4℃下，肌球蛋白重鏈(MHC)、副肌球蛋白(PM)、肌動球蛋白(Actin)48 h內無明顯變化;25℃下，MHC溫浴12 h后開始發生明顯的降解，24 h后完全降解;40℃時，降解嚴重，溫浴0.5 h后，MHC就發生明顯的降解，1.5 h后基本上降解完全，在南海鳶烏賊胴體肌肉中存在金屬蛋白酶，它會使MHC發生降解，從而影響肌肉蛋白的加工性質，其最適溫度為40℃，通過添加1 mmol的EDTA，可以顯著抑制該金屬蛋白酶的活性。在鳶烏賊魚糜制品的加工中，為了獲得更好的凝膠性能，應繼續研究抑制此蛋白酶的方法。

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