酸法脫酰胺處理對大米蛋白功能特性的影響

聶小華，龔燕丹，許丹，沈燕飛

(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院食品科學(xué)與工程系，浙江杭州，310014)

我國是世界大米生產(chǎn)大國，除滿足人們?nèi)粘ｏ嬍承枰?，尚有很大比例的早秈米、陳化米和碎米等因可食用品質(zhì)差而被用作味精、有機酸、抗生素發(fā)酵和淀粉糖漿生產(chǎn)的原料，加工過程中可產(chǎn)生大量的米渣，含有40% ～70%蛋白質(zhì)(干重);但目前米渣多用作動物飼料營養(yǎng)添加劑，這對我國本來就相對匱乏的蛋白資源造成巨大浪費。

大米蛋白是營養(yǎng)界公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，具有生物效價高、致敏性低等特點。由于80%大米蛋白為堿溶性谷蛋白，其分子中有大量酰胺基團，通過氫鍵使蛋白質(zhì)分子聚集［1］，導(dǎo)致其在近中性pH環(huán)境下水溶性較差，繼而影響到乳化性、起泡性等功能性質(zhì)，從而極大限制了大米蛋白在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用。脫酰胺是改善難溶性植物蛋白常用方法之一。通過脫酰胺可去除蛋白質(zhì)中谷氨酰胺和天冬酰胺基團的氨基，使蛋白質(zhì)氨基酸殘基及多肽鏈結(jié)構(gòu)改變，形成親水性基團［2］，有效改善蛋白質(zhì)的溶解性等功能性質(zhì)。其中酸法脫酰胺成本低廉、工藝簡便，國內(nèi)外已有許多難溶性植物蛋白經(jīng)脫酰胺改性后，溶解性等功能性質(zhì)得到顯著改善的報道［3-5］。本文采用HCl對大米蛋白進行脫酰胺改性，研究了不同脫酰胺程度的大米蛋白在溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

大米蛋白:實驗室從米渣中提取，蛋白純度88.2%。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米蛋白的脫酰胺處理

稱取2.25 g大米蛋白分散于50 mL 0.3 mol/L HCl，室溫下磁力攪拌30 min后于85℃水浴中反應(yīng)，時間分別為1、2、3、4 h。反應(yīng)結(jié)束后快速冷卻至室溫，調(diào)整pH至中性，即可獲得不同脫酰胺度的大米蛋白反應(yīng)液。一部分反應(yīng)液置于4℃冷藏，用于脫酰胺度和水解度測定，另一部分超濾去鹽后冷凍干燥，用于蛋白功能特性測定。

1.2.2 脫酰胺度(DD)測定

取脫酰胺大米蛋白反應(yīng)液5 mL與5 mL 15% 三氯乙酸(TCA)混合均勻，靜置30 min過濾，用水楊酸-次氯酸鹽光度法［6］測定濾液中游離氨含量，計算脫酰胺大米蛋白反應(yīng)液中游離氨含量。

大米蛋白酰胺基總量測定參考姜紅［7］的方法。精確稱取1.000 g大米蛋白，加入10 mL 12 mol/L HCl，抽真空后密封，于130℃水解3 h。水解完畢后將水解液pH調(diào)至中性，用無氨水定容至100 mL，按上述方法測定計算出大米蛋白酰胺基總量。

脫酰胺度/%=(樣品中游離氨含量/樣品中酰胺基總量)×100

1.2.3 水解度(DH)測定

參考檀志芬等［8］方法。取5 mL脫酰胺大米蛋白反應(yīng)液與5 mL 15%TCA混合均勻，靜置30 min過濾，采用微量雙縮脲法［9］測定濾液中蛋白質(zhì)含量。

水解度(DH)/%=(樣品中15%TCA可溶性蛋白含量/樣品總蛋白質(zhì)含量)×100

1.2.4 溶解性測定

參照 Ahmedna［10］方法。用 pH 7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液配制0.5%蛋白分散液，室溫磁力攪拌1 h后離心(10 000 r/min，15 min)，采用微量雙縮脲法［9］測定上清液蛋白質(zhì)含量。

溶解度/%=(樣品上清液中蛋白含量/樣品中總蛋白含量)×100

1.2.5 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

乳化性測定參考 Webb［3］方法。用 pH 7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液配制1.0%蛋白分散液，取15 mL蛋白分散液置于50 mL燒杯中，加入5 mL大豆油，均質(zhì)(10 000 r/min，1 min)得到乳狀液，分別于0 min和10 min從距底部0.5 cm處吸取50 μL乳濁液，迅速加至5 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm處測定吸光值。

乳化活性(EA)/(m2·g-1)=2×(2.303×A0/l)/(Φ ×m)

式中:A0為0 min時吸光值，l為比色皿寬度(m)，Φ為油占的體積分?jǐn)?shù)，m為乳化前溶液蛋白質(zhì)質(zhì)量(g)。

乳化穩(wěn)定性(ES)/%=100×(A10/A0)

式中:A0和A10分別為0 min和10 min時500 nm處吸光值。

1.2.6 起泡能力及起泡穩(wěn)定性測定

起泡性能測定參照 Ahmedna［10］的方法。用pH 7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液配制0.6%蛋白分散液，取其20 mL置于100 mL量筒中，均質(zhì)(10 000 r/min，1 min)，立即讀取泡沫體積V0;室溫靜置10 min，讀取泡沫體積V10。

起泡能力(FA)/%=(V0/20)×100

起泡穩(wěn)定性(FS)/%=(V10/V0)×100

1.2.7 表面疏水性測定

采用溴酚藍(BPB)結(jié)合法［13］測定。用pH 7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液配制1%蛋白分散液，取1 mL蛋白分散液與200 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液混合，離心(4 500 r/min，15 min)，上清液稀釋10倍后于595 nm下測定吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫酰胺處理時間對大米蛋白脫酰胺度和水解度的影響

大米蛋白脫酰胺效果隨著處理時間的變化如圖1所示。隨著反應(yīng)時間增加，大米蛋白脫酰胺度和水解度隨之增加，其中蛋白脫酰胺速率在0.5～1.0 h最大。當(dāng)脫酰胺處理時間分別為1、2、3、4 h時，大米蛋白的脫酰胺度分別10.55%、15.16%、18.70%、22.84%，水解度分別為7.90%、9.76%、11.92%、14.29%。

圖1 脫酰胺時間對大米蛋白脫酰胺度和水解度的影響Fig.1 Effect of time on deamidization degree and hydrolysis degree of rice protein

2.2 大米蛋白脫酰胺對功能性質(zhì)的影響

2.2.1 脫酰胺處理對大米蛋白溶解性的影響

由圖2可知，脫酰胺大米蛋白在pH 2.0～11.0內(nèi)溶解性得到顯著提高。當(dāng)pH 5.0時，由于該pH值接近大米蛋白等電點，對照組溶解度僅為1.2%，脫酰胺大米蛋白溶解度增加至10% ～15%;pH 5.0～8.0內(nèi)大米蛋白溶解度隨脫酰胺度增加而顯著上升，而pH 2.0～3.5和pH 9.5～11.0內(nèi)脫酰胺程度處理對大米蛋白溶解性無明顯作用，這可能是因為蛋白質(zhì)溶解性受電荷數(shù)和疏水性的影響，在此pH值下大米蛋白帶有大量靜電荷，自身就具有很好溶解性。因此脫酰胺處理可明顯提高大米蛋白溶解性，這是由于(1)HCl脫除了蛋白分子中酰胺基團中氨基，形成親水性羧基，增強靜電斥力，促進蛋白質(zhì)分子展開，有利于蛋白質(zhì)溶解;(2)鹽酸使蛋白質(zhì)發(fā)生部分水解，產(chǎn)生了分子量更小的蛋白質(zhì)和肽，暴露了更多親水性基團。

圖2 脫酰胺處理時間對大米蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of deamidization time on the solubility of rice protein at different pH values

2.2.2 脫酰胺處理對大米蛋白乳化性的影響

乳化性包括乳化活性(EA)和乳化穩(wěn)定性(ES)，是食品蛋白質(zhì)的重要功能性質(zhì)之一。由圖3可知，脫酰胺處理可促使大米蛋白乳化活性顯著增加(P＜0.05)，且兩者呈正相關(guān)性;對照組乳化活性為2 500 m2/g，脫酰胺大米蛋白乳化活性增加了2.69～4.67倍。此外，脫酰胺處理在一定程度上可提高大米蛋白的乳化穩(wěn)定性，但未呈現(xiàn)一定規(guī)律性，其中脫酰胺處理1 h和4 h可明顯提高大米蛋白的乳化穩(wěn)定性，分別由原來的28.85%增加至60.11%和97.83%。這是因為脫酰胺處理促進了大米蛋白的溶解，使其發(fā)揮出較好的乳化性。正如Ahmedna［10］認(rèn)為，難溶性蛋白的乳化活性隨溶解度增加而增強;廖蘭［4］亦指出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解性得到改善時，其吸附到油水界面的幾率增大，從而改善了其乳化活性。但脫酰胺大米蛋白乳化穩(wěn)定性呈先下降再上升的趨勢，這可能是因為隨著脫酰胺程度增加，大米蛋白表面疏水性先減弱后增強，而表面疏水性下降會削弱非極性基團與油脂的相互作用，使乳化穩(wěn)定性降低［3］。

圖3 脫酰胺時間對大米蛋白乳化能力和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of deamidization time on the EA and ES of rice protein

圖4 脫酰胺時間對大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of deamidization time on the forming ability and form stability of rice protein

2.2.3 脫酰胺處理對大米蛋白起泡性的影響

起泡性是食品蛋白質(zhì)的另一個重要功能性質(zhì)。由圖3可知，脫酰胺大米蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性得到顯著增加(P＜0.05);對照組起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別為40.00%和29.73%;脫酰胺大米蛋白則分別提高了5～6倍和近2倍，這與Ahmedna等人［10］的研究結(jié)果一致。在脫酰胺處理初始階段，大米蛋白起泡能力顯著增強主要歸因于蛋白質(zhì)溶解性提高促使大量蛋白質(zhì)分子擴散至氣/液界面，以及暴露的疏水性基團利于蛋白質(zhì)與疏水性的空氣表面結(jié)合［5］;同時靜電荷含量亦影響蛋白質(zhì)在空氣/水界面的吸附，脫酰胺處理能夠增加蛋白的靜電荷，因而可以使蛋白起泡性增強［11］。而隨著脫酰胺處理時間延長至3 h，大米蛋白泡沫穩(wěn)定性有所下降;這可能是脫酰胺導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解使分子量降低，不利于蛋白在氣泡周圍形成強韌的薄膜。

2.2.4 脫酰胺處理對大米蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性反映了蛋白質(zhì)表面的疏水基團含量，經(jīng)常用來探究蛋白質(zhì)功能性質(zhì)［13］。本實驗采用的溴酚藍結(jié)合法更適合難溶性蛋白表面疏水性測定［13］，以蛋白質(zhì)結(jié)合溴酚藍的能力作為衡量表面疏水性的指標(biāo)，溴酚藍結(jié)合能力隨蛋白質(zhì)疏水性增加而增強。由表3可知，大米蛋白的溴酚藍結(jié)合能力為12.75 μg/mg蛋白質(zhì)，而每毫克脫酰胺大米蛋白可結(jié)合的溴酚藍明顯降低(P＜0.05)。隨著脫酰胺時間增加，大米蛋白表面疏水性呈現(xiàn)先降后升的趨勢;當(dāng)脫酰胺處理2h時大米蛋白表面疏水性最低(9.45 μg/mg蛋白質(zhì));這是因為在脫酰胺的起始階段(0～1 h)脫酰胺反應(yīng)活躍，疏水性酰胺基團形成親水性羧基，從而降低蛋白質(zhì)表面疏水性。隨著反應(yīng)繼續(xù)進行，大米蛋白水解程度增加，原來被掩蔽的內(nèi)部疏水基團得到更多的釋放，使蛋白表面疏水性提高。

表3 脫酰胺處理時間對大米蛋白表面疏水性的影響Table 3 Effect of deamidization time on the surface hydrophobicity of rice protein

3 結(jié)論與展望

研究結(jié)果表明，鹽酸脫酰胺處理可顯著改善大米蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)。中性條件下脫酰胺處理4 h的大米蛋白溶解度提高了約7.86倍，乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了4.67倍、3.39倍;起泡能力和泡沫穩(wěn)定性達到較高，分別提高了5.92倍、1.92倍。因此，鹽酸脫酰胺處理可作為經(jīng)濟高效的蛋白改性方法，改善大米蛋白功能特性和促進其在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用，為米渣資源的高值化利用提供可能。

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