歐李紅色素在復雜體系中的抗氧化作用*

左玉，馮麗霞，朱瑞濤，張彩鳳，謝文磊

1(太原師范學院 化學系，山西太原，030031)2(河南工業大學化學化工學院，河南鄭州，45001)

歐李是一種營養價值較高的水果，含有多種維生素、微量元素和氨基酸［1］，在食品、醫藥、飲料等加工業方面有很大的發展前景［2-3］。歐李果含有大量的花青素，即歐李紅色素，為黃酮類花色苷化合物［4-5］。

本研究用水溶性的偶氮化合物AAPH熱分解生成的自由基引發脂質氧化，通過硫氰酸鐵法(FCT)和硫代巴比妥酸反應物法(TBARS)檢測脂質的氧化進程，研究歐李紅色素在用大豆磷脂脂質體模擬非均相生物體系和用非離子表面活性劑Tween 20穩定的葵花油水包油乳狀液模擬非均相食品體系中的抗氧化活性，同時也研究VC或VE的加入對歐李紅色素抗氧化活性的影響，以期明確歐李紅色素在復雜體系下的抗氧化行為及其協同作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐李紅色素:歐李果肉以酸性乙醇溶液浸提，浸提液45℃浴溫真空濃縮，濃縮浸提液以AB-8大空吸附樹脂吸附，乙醇洗脫，洗脫液經濃縮干燥得歐李紅色素結晶。

大豆磷脂，黑龍江前進油廠;葵花籽油，天津嘉里糧油工業有限公司;Tween 20，上海三浦化學試劑公司;AAPH［2，2-偶氮(2-脒基丙烷)鹽酸］，ALDRICH化學試劑公司;抗壞血酸(VC)，洛陽化學試劑廠;α-生育酚(VE)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)(純度 ＞97%)，Sigma公司;FeCl2·4H2O(含量 ＞ 99.7%)，天津雙船化學試劑廠;2-硫代巴比妥酸(TBA)，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司;三氯乙酸(TCA)，上海化學試劑采購供應站;NH4SCN(含量 ＞98.5%)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、CHCl3、無水乙醇，洛陽化學試劑廠。試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

722S型分光光度計、KQ-100超聲波清洗儀、旋轉蒸發器RE-52C、SHZ-DA(Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義市英裕予華儀器廠;SHZ-C水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市華鋒儀器有限公司;80-1型離心沉淀機、TL80-2型醫用離心機，江蘇姜堰市天力醫療器械有限公司;101-2S型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海路達實驗儀器廠;微量加樣器(10～100 μL)，上海青花儀器廠;微量加樣器(100～500 μL)，上海求精生化試劑儀器有限公司;BS224S萬分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總酚含量的測定

按Folin-Ciocalteu法［6］進行測定，以原兒茶酸為標準物。取0.500 0 g沒食子酸，用10 mL乙醇溶解，再用蒸餾水定容至100 mL。然后，分別移取0、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL用乙醇溶解的沒食子酸溶液，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。此溶液為標準溶液。從不同濃度的標準溶液中分別移取1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，再在6個容量瓶中分別加入60 mL蒸餾水和5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合均勻。在0.5～8.0 min內，加入15 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至100 mL。將上述標準溶液于20℃下在暗處放置2 h后，在765 nm波長下測定吸光值，繪制標準曲線。回歸方程為:y=7.187 5 x-0.009 1，R2=0.999 7。

取0.25 mg/mL歐李紅色素0.5 mL，按標準曲線法測量其酚含量。

1.3.2 大豆磷脂脂質體的制備

按薄膜法［7］進行，稱取10.0 g大豆磷脂，用三氯甲烷溶解定容至250 mL(40 mg/mL)，儲存于冰箱中備用。再量取10.0 mL大豆磷脂的三氯甲烷溶液于100 mL圓底燒瓶中，45℃減壓蒸去三氯甲烷，加入含有水溶性抗氧化劑歐李紅色素的磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.4)，使總體積為50 mL。將混合液劇烈搖動，并在超聲波振蕩器中振蕩20 min，制備脂質體，脂質體溶液呈乳白色不透明狀。

1.3.3 葵花油水包油乳狀液的制備

乳狀液的制備參考 Yen等［8］和 Chang等［9］的工作，具體操作如下:稱取5.0 g葵花油置于100 mL圓底燒瓶中，依次加入25 mL含20 mg/mL Tween 20的磷酸鹽緩沖溶液、含有水溶性抗氧化劑歐李紅色素的磷酸鹽緩沖溶液，再添加磷酸鹽緩沖溶液，使總體積為50 mL。將混合液劇烈搖動，并在超聲波振蕩器中振蕩20 min，形成乳白色不透明乳狀液。

1.3.4 脂質的氧化

本研究采用水溶性偶氮化合物AAPH作為引發劑，加速大豆磷脂脂質體和葵花油乳狀液的氧化。

向大豆磷脂脂質體分散液中加入5 mg/mL AAPH 0.5 mL，或葵花油水包油乳狀液中加入5 mg/mL AAPH 1.0 mL后，置于轉速約為175 r/min的水浴恒溫振蕩器中，恒溫37℃發生氧化反應。在脂質體中抗氧化劑的添加量分別為0.001 6 mg/mL(歐李紅色素的質量為0.08 mg，下同)、0.004 mg/mL(0.2 mg)、0.008 mg/mL(0.4 mg)(濃度相當于磷脂質量的0.02%、0.05%、0.10%)，在乳狀液中歐李紅色素的添加量分別為0.02 mg/mL(1 mg)、0.05 mg/mL(2.5 mg)、0.10 mg/mL(5 mg)(濃度相當于油重的0.02%、0.05%、0.10%)，考查不同濃度歐李紅色素在大豆磷脂脂質體和葵花油乳狀液中作為抗氧化劑的作用和效果。需要說明的是，在上述2種非均相體系中所使用的歐李紅色素的添加量均能使其顯示出較好的抗氧化性，且濃度之間有一定的數量關系，易于了解歐李紅色素的抗氧化作用隨濃度變化的變化趨勢和規律。然后每隔1.5 h定時取樣進行分析，用FTC法和TBARS法檢測脂質的氧化進度，同時做空白實驗(即在大豆磷脂脂質體和葵花油乳狀液中不加歐李紅色素)。每組實驗均作雙份平行樣，重復做3次，結果以平均值表示。

1.3.5 抗氧化活性的測定

1.3.5.1 硫氰酸鐵法(FTC法)

FCT法可測定脂質氧化的初級產物脂質過氧化物，其原理是:脂質氧化產生的過氧化物能將Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+與NH4SCN反應，形成紅色的硫氰酸鐵絡合物，在500 nm處有最大吸收，高的吸光度值表示脂質氧化的程度高。本實驗采用 Mitsuda等人［10-11］的方法:每隔1.5 h取0.1 mL反應液，加入體積分數75%乙醇4.7 mL與30%NH4SCN 0.1 mL，再加入0.02 mol/L的FeCl2/3.5%HCl溶液0.1 mL，在室溫下反應3 min，于500 nm處測量吸光度。吸光度值與過氧化物的量符合朗伯-比爾定律。

1.3.5.2 硫代巴比妥酸反應物法(TBARS法)

采用Kosugi等人的方法測定脂質過氧化物降解產生的丙二醛MDA［12］，并稍有改動。每隔1.5 h取0.5 mL反應液，加入2.8 mg/mL的 TBA 2 mL、0.2 mg/mL的TCA 2 mL和0.8 mg/mL的TBHQ 1 mL(TBHQ的加入是為了防止脂質過氧化產物與TBA共熱時分解生成可與TBA反應，而使氧化反應終止的物質)。將混合溶液置于沸水浴中加熱20 min，用自來水冷卻10 min，加入2 mL氯仿，離心10 min(3 000 r/min)。取上清液在532 nm處測其吸光度。

1.4 抑制率的計算

其中:A空白和A樣品分別為t時間空白試驗和對應時間點被測樣品的吸光度。

1.5 數據處理與分析

每次實驗至少平行進行3次，采用Origin 8.0和Microsoft Excel數據分析軟件對實驗數據進行計算和相關統計學分析，并以平均值±標準偏差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)。對各組數據采用方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 大豆磷脂和葵花油的脂肪酸組成(表1、表2)

表1 葵花油的主要脂肪酸組成Table 1 The main composition of fatty acid in sunflower oil

表2 大豆磷脂的主要脂肪酸構成Table 2 The main composition of fatty acid in soybean phosphatidylcholine

2.2 不同濃度歐李紅色素對復雜體系中脂質氧化的影響

2.2.1 大豆磷脂脂質體

圖1為在大豆磷脂脂質體中添加不同濃度的歐李紅色素后對脂質氧化過程中過氧化物和丙二醛的變化情況。不同濃度歐李紅色素對大豆磷脂脂質體的氧化均具有明顯的抑制作用，不同濃度歐李紅色素的抗氧化活性不同，其抗氧化活性順序為0.001 6 mg/mL＞0.00 4 mg/mL＞0.008 mg/mL，說明在實驗濃度范圍內隨著濃度增加抗氧化活性下降。

圖1 不同濃度歐李紅色素在大豆磷脂脂質體中對脂質過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.1 Effect of different concentrations of the red pigments of Cerasus humilis on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.A control was without sample

通過計算抑制率，濃度為0.001 6、0.004和0.008 mg/mL的歐李紅色素抑制脂質過氧化物的能力分別為18.89%、15.21%、11.52%(P ＜0.05，以下均相同)，抑制 TBARS的生成的能力分別為36.21%、33.62%、31.90%。以上數據顯示，這種因濃度不同而引起的抗氧化活性差異對抑制氧化后期產物的生成要比抑制過氧化物的生成大。

2.2.2 葵花油水包油乳狀液

圖2為歐李紅色素在葵花油乳狀液中抑制脂質氧化的情況。不難看出，歐李紅色素在一定程度上阻止了葵花油乳狀液的氧化，并且抗氧化活性隨其濃度的升高而降低，即抗氧化活性順序為0.02 mg/mL＞0.05 mg/mL＞0.10 mg/mL，與脂質體具有相似的抗氧化規律。

圖2 不同濃度歐李紅色素在葵花油乳狀液中對脂質過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.2 Effect of different concentrations of the red pigments of Cerasus humilis on oxidative stability in sunflower oil-in-water emulsions stabilized by Tween-20 in the presence of 30 μM AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS.A control was without sample

反應初期，FTC法和TBARS法的吸光度值均增加較快，但隨著反應的進行，吸光度增加的趨勢逐漸減慢，說明歐李紅色素的消耗隨時間的增加逐漸加快，其抑制脂質氧化的能力下降。通過公式計算抑制率，濃度為0.02、0.05和0.10 mg/mL的歐李紅色素抑制脂質過氧化物的能力分別為19.97%、18.93%、17.73%，抑制TBARS的生成的能力分別為73.23%、57.85%、55.38%。

以上實驗結果說明歐李紅色素作為抗氧化劑加入到大豆磷脂脂質體和葵花油乳狀液后，具有很好的抗氧化作用，可作為天然抗氧化劑使用。

多項研究表明，黃酮類花色苷是一種具有抗輻射、抗炎和抗癌等重要生理和生物學功能的抗氧化劑和自由基捕獲劑［13］。花青素還能與VC和VE等抗氧化劑之間產生協同效應，具有增效劑的作用。

用標準曲線法測量歐李紅色素的酚含量為(16.51±0.8)mg/g干重，表明了其抗氧化活性可能是存在酚羥基之原因。酚類化合物與脂質自由基反應后形成的自由基穩定性較高，其原因是未成對的電子可以在苯環上離域分布。

根據Arit等人［14］的報道，花色苷或其他黃酮類物質的抗脂質氧化機理主要是花青素分子中的多個酚羥基可以作為氫供體，對多種活性氧和自由基均具有清除作用，生成活性較低的原花色素自由基，打斷自由基的鏈反應，減少自由基的產生。

2.3 不同濃度歐李紅色素和VC對復雜體系中脂質氧化的影響

人們在篩選抗氧化劑的過程中，發現在一些生物抗氧化劑里添加VC、VE或BHT、BHA等，其所形成的抗氧化劑復合體的抗氧化效果往往強于單一抗氧化劑的抗氧化效果，這種作用稱為協同作用。

本實驗研究歐李紅色素與VC或VE共同作用時所形成的復合抗氧化劑的抗氧化活性，所得數據采用加和法和直接比較法進行分析。2種方法說明如下:(1)加和法使用的公式為Y=P(x1+x2)-(Px1+Px2)，Y為復合抗氧化劑的抑制率和單一組分在相同濃度下抑制率總和的差值。Y＞0，說明組分間存在正協同作用，簡稱協同作用;Y＜0，說明組分間存在負協同作用，稱為無協同作用。(2)直接比較法。若歐李紅色素與VC或VE形成的復合抗氧化劑的抑制率大于等濃度的歐李紅色素或VC或VE的抑制率，則表明組分間存在協同作用，反之則為無協同作用［15］。

2.3.1 大豆磷脂脂質體

圖3為歐李紅色素與VC加入大豆磷脂脂質體中用FTC法和TBARS法測得的磷脂氧化行為。在FTC法中(圖3-A)，加入0.001 6 mg/mL VC的復合抗氧化劑的吸光度值較高于單一歐李紅色素和VC的值，說明了2種抗氧化劑共同使用的抗氧化效果不如單一歐李紅色素和VC。抑制率如下:0.001 6 mg/mL VC+0.001 6 mg/mL 色素，11.29%;0.001 6 mg/mL VC+0.008 mg/mL色素，11.06%，均低于0.001 6 mg/mL VC、0.001 6 mg/mL 色素、0.008 mg/mL 色素的抑制率(分別為21.89%、18.89%、11.52%)，表明了0.001 6 mg/mL VC降低了歐李紅色素的抗氧化能力，顯示一定的助氧化作用。TBARS法測得(圖3-B)，0.001 6 mg/mL VC、0.001 6 mg/mL 色素、0.008 mg/mL色素、0.001 6 mg/mL VC+0.001 6 mg/mL色素和0.001 6 mg/mL VC+0.008 mg/mL色素的抑制率分別為58.62%、36.21%、31.90%、50.09%和41.38%，均低于0.001 6 mg/mL VC的抑制率(58.62%)，說明復合抗氧化機劑不顯示協同作用。但通過比較發現，歐李紅色素與0.001 6 mg/mL VC共同作用時，抑制大豆磷脂脂質體氧化的能力比歐李紅色素單獨作用時略微增強。

圖3 不同濃度歐李紅色素和VC在大豆磷脂脂質體中對脂質過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.3 Interaction of the red pigments of Cerasus humilis and ascorbic acid on oxidative stability in soybean PC liposome in the presence of 15 μM AAPH at 37℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS

通過對大豆磷脂脂質體中抗氧化行為的研究，發現VC的加入并沒有明顯改善歐李紅色素的抗氧化能力。由于VC是較好的水溶性抗氧化劑，而歐李紅色素在水中的溶解度小于VC，使得VC更易發揮其抗氧化作用，所以VC與歐李紅色素共同作用沒有VC單獨使用時的抗氧化效果最好。

2.3.2 葵花油水包油乳狀液

圖4-A為在葵花油乳狀液中加入色素、VC及其復合物后脂質的氧化曲線。可以看出，當歐李紅色素和VC的濃度均為0.02 mg/mL時，2種抗氧化劑的抗氧化作用差異非常顯著，VC的抗氧化能力明顯高于歐李紅色素。色素、VC及其復合物抗氧化性能大小順序為:0.02 mg/mL VC(抑制率為82.12%，下同)＞0.02 mg/mL色素 +0.02 mg/mL VC(24.29%)＞0.10 mg/mL色素 +0.02 mg/mL VC(22.50%)＞0.02 mg/mL色素 (19.97%)＞0.10 mg/mL色素(17.73%)。該實驗結果說明了加入VC后，復合物的抗氧化活性增加，但這種水溶性抗氧化劑沒有顯示協同抗氧化作用。由圖4-A還可看出，在歐李紅色素中加入VC后所表現出的隨濃度變化規律與未加入相同，即隨色素濃度升高，抑制率下降。

用TBARS法檢測到的結果與FTC法明顯不同，歐李紅色素與VC對葵花油乳狀液后期氧化物的抑制能力差異不大。由圖4-B可看出，色素、VC及其復合物抗氧化性能的大小順序為0.02 mg/mL色素＞0.02 mg/mL VC＞0.02 mg/mL色素+0.02 mg/mL VC＞0.10 mg/mL色素＞0.10 mg/mL色素+0.02 mg/mL VC，抑 制率 依 次 為 73.23%、67.08%、60.62%、55.38%和43.08%，說明了VC的加入并沒有改善歐李紅色素的抗氧化活性，反而使得復合抗氧化劑的抑制率低于單一抗氧化劑的抑制率，即顯示負協同作用。

圖4 不同濃度歐李紅色素和VC在葵花油乳狀液中對脂質過氧化物(FTC)(A)和MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.4 Interaction of the red pigments of Cerasus humilis and ascorbic acid on oxidative stability in sunflower oil-in-water stabilized by Tween-20 in the presence of 30 μM AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS

2.4 不同濃度歐李紅色素和VE對復雜相體系中脂質氧化的影響

2.4.1 大豆磷脂脂質體

考察了VE、歐李紅色素及其不同配比復合物對大豆磷脂脂質體氧化的過氧化物生成量的影響，實驗結果見圖5-A。從圖5-A可看出，加入0.001 6 mg/mL VE的復合抗氧化劑的吸光度值較高于單一歐李紅色素和VE的值，說明了2種抗氧化劑共同使用的抗氧化效果不如單一歐李紅色素和VE。抑制率如下:0.001 6 mg/mL VE+0.001 6 mg/mL色素，10.60%;0.001 6 mg/mL VE+0.008 mg/mL色素，11.29%，均低于 0.001 6 mg/mL VE、0.001 6 mg/mL色素、0.008 mg/mL色素的抑制率(分別為32.72%、18.89%、11.52%)，說明加入VE后使色素的抗氧化活性降低，因而也就不存在它們之間的協同作用。

圖5-B是用TBARS法測定的VE、歐李紅色素及其不同配比復合物對大豆磷脂脂質體后期氧化產物生成量的影響。0.001 6 mg/mL VE、0.001 6 mg/mL色素、0.008 mg/mL色素、0.001 6 mg/mL VE+0.001 6 mg/mL色素和0.001 6 mg/mL VE+0.008 mg/mL色素的抑制率分別為 66.38%、36.21%、31.90%、58.62%和62.93%。可以看出，復合抗氧化劑的抗氧化活性不如相應濃度VE的抗氧化活性高，但比相應濃度的色素抗氧化活性高，VE和色素沒有協同作用。圖7-B表明，在大豆磷脂脂質體中，VE、色素及其復合物抑制后期過氧化產物丙二醛生成的活性比抑制過氧化物生成的活性高。

圖5 不同濃度歐李紅色素和VE在大豆磷脂脂質體中對脂質過氧化物(FTC)(A)和對MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.5 Interaction of the red pigments of Cerasus humilis and α-tocopherol on oxidative stability in soybean liposome in the presence of 15 μmol/L AAPH at 37 ℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS

2.4.2 葵花油水包油乳狀液

圖6為歐李紅色素與VE加入葵花油乳狀液中用FTC法和TBARS法測得的抗氧化行為，FTC法測定結果表明(圖6-A)當濃度均為0.02 mg/mL時，歐李紅色素和VE的抗氧化活性差異非常顯著，VE氧化能力明顯高于同濃度的色素。色素、VE及其復合物抗氧化性能的大小順序為0.02 mg/mL VE＞0.02 mg/mL色素+0.02 mg/mL VE＞0.10 mg/mL色素+0.02 mg/mL VE＞0.02 mg/mL色素＞0.10 mg/mL色素，抑制率依次為69.15%、28.32%、21.91%、19.97%和17.73%。用加和法考察其協同作用，Y1=P(0.02mg/mL色素+0.02mg/mL VE)-(P0.02mg/mL色素+P0.02mg/mL VE)=28.32%-(19.97%+69.15%)=-60.80% ＜＜0，Y2= P(0.10mg/mL色素+0.02mg/mL VE)- (P0.10mg/mL色素+P0.02mg/mLVE)=21.91%-(17.73%+69.15%)=-64.97% ＜＜0，表明復合抗氧化劑沒有協同作用。雖然復合抗氧化劑的抗氧化活性比相應濃度的歐李紅色素高，但卻低于相應濃度的VE的抗氧化活性。

圖6 不同濃度歐李紅色素和VE在葵花油乳狀液中對脂質過氧化物(FTC)(A)和對MDA生成量的影響(TBARS)(B)Fig.6 Interaction of the red pigments of Cerasus humilis and α-tocopherol on oxidative stability in sunflower oil-inwater emulsion stabilized by Tween-20 in the presence of 30 μmol/L AAPH at 37℃:(A)lipids peroxides;(B)TBARS

用TBARS法檢測到的結果與FTC法不同，同濃度的歐李紅色素與VE的抗氧化能力差異不大。由圖6-B可看出，色素、VE及其復合物抗氧化性能的大小順序為0.02 mg/mL色素 ＞0.02 mg/mL VE＞0.02 mg/mL色素+0.02 mg/mL VE＞0.10 mg/mL色素＞0.10 mg/mL色素 +0.02 mg/mL VE，抑制率依次 為 73.23%、69.85%、62.15%、55.38% 和52.00%，說明色素和VE沒有抑制后期過氧化生成的協同作用。

3 結論

在大豆磷脂脂質體和葵花油乳狀液中，用FTC法和TBARS法測得的不同濃度歐李紅色素均具有抗氧化活性，但在不同體系中其抗氧化活性并不相同，隨著歐李紅色素濃度增加抗氧化活性下降。通過考察2種抗氧化劑的協同作用，發現各種不同濃度的歐李紅色素與VC或VE共同作用時均不顯示協同增效作用。在大豆磷脂脂質體中，FTC法測得VC或VE的加入使2種濃度歐李紅色素抗氧化能力下降，TBARS法測得VC或VE的加入使2種濃度歐李紅色素抗氧化能力明顯提高;同時，VC的加入使復合抗氧化劑的抗氧化活性隨其中歐李紅色素濃度的增加而降低，VE的加入使復合抗氧化劑的抗氧化活性隨其中歐李紅色素濃度的增加而增加。在葵花油乳狀液中，FTC法測得VC或VE的加入使2種濃度歐李紅色素抗氧化能力略微提高，TBARS法測得VC或VE的加入使2種濃度歐李紅色素抗氧化能力明顯降低，2種方法均顯示隨著歐李紅色素濃度增加復合抗氧化劑的抗氧化活性下降，說明歐李紅色素作為一種抗氧化劑具有較好的應用前景。

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