超聲輔助提取麻竹筍多糖*

鄭炯，吳金松，闞建全

1(西南大學食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

3(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

竹筍(bamboo shoot)是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)植物的新生芽，一直以來以高纖維、低脂、營養豐富的“素食第一品”著稱［1］。竹筍含有豐富的膳食纖維，具有促進消化、降低血清膽固醇以及預防心血管疾病和癌癥等作用［2-8］。麻竹筍作為產筍量較高的品種之一，同樣具有較高的營養價值。從麻竹筍中提取出的多糖可以作為益生元，同時具有抗氧化的活性［9-11］，具有較高的開發和應用價值，然而國內外對麻竹筍多糖的提取方法報道較少。

目前關于竹筍多糖的提取工藝研究，主要有水提醇沉法、酸堿水解法和酶法輔助提取法［12-15］等傳統方法，而對于超聲波輔助提取工藝的研究鮮有報道。超聲波輔助提取方法是從植物中提取有效成分的一種重要方法，主要是依靠超聲波的“空化作用”及其次級效應，加速細胞壁的破碎，促進胞內多糖的流出，減少提取時間［16-19］。本實驗擬采用響應面曲線法，以麻竹筍多糖提取率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心設計法對超聲功率、提取溫度、提取時間等關鍵因素進行優化，建立并驗證相關的工藝數學模型，并對提取的多糖進行了紅外光譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻竹筍，采自重慶市北碚區施家梁鎮麻竹筍種植基地。

葡萄糖標品，美國Sigma公司;無水乙醇、苯酚、硫酸、無水乙醚、丙酮等，均為國產分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA2004分析天平，沈陽龍騰電子儀器有限公司;722可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;SHZ-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器有限公司;JP-500B高速多功能粉碎機，永州市九品工貿有限公司;SB25-12DTD臺式超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司;Spectrum-100 FT-IR紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波輔助提取麻竹筍多糖工藝

新鮮麻竹筍→去殼、切片、烘干、粉碎成末→脫脂→稱取5g→超聲輔助提取→離心分離→上清液濃縮→醇沉→離心分離→無水乙醇、丙酮、石油醚抽洗→干燥→竹筍多糖

準確稱 5 g竹筍粉，以 40∶1的水料比(mL∶g)［20］，以不同超聲波提取功率、不同超聲提取時間以及不同超聲溫度提取，將提取液離心，其殘渣按照同樣的超聲提取條件重復提取1次，合并提取液，用旋轉蒸發器真空濃縮，加4倍于多糖溶液體積的無水乙醇沉淀多糖，用無水乙醇、丙酮多次洗滌后，多糖再復溶入水，冷凍干燥即得麻竹筍多糖［21］。

1.3.2 單因素試驗

參考相關文獻［22-23］，在推薦的最佳超聲波輔助提取工藝條件下，以時間(30 min)、溫度(50℃)和功率(頻率20 Hz，功率360 W)為參考，變換各個單因素水平進行試驗，考察其對麻竹筍多糖提取率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取超聲時間、超聲功率、超聲溫度為自變量，麻竹筍多糖提取率為響應值，根據Box-Behnken試驗設計方法，進行3因素3水平的響應面分析試驗，因素與水平見表1。通過Design Expert 8.0.7軟件對試驗數據進行回歸分析，預測超聲輔助提取麻竹筍多糖提取的最佳工藝。平行試驗3次，進行驗證試驗。

表1 響應面(RSA)試驗因素水平表Table 1 Factor levers of the response surface test

1.3.4 多糖含量和提取率的測定

1.3.4.1 葡萄糖含量標準曲線的繪制

多糖含量采用硫酸-苯酚法［16-18］。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 0.1 mg/mL 葡萄糖標準液定容至1.0 mL。加入5%的苯酚溶液1 m、5 mL濃H2SO4，立即混勻，靜置30 min，室溫條件下于波長490 nm處測定吸光度。根據測定的值與標準溶液濃度之間的關系制作標準曲線，得回歸方程為:y=0.008 3x+0.020 9，R2=0.998 9。

1.3.4.2 麻竹筍多糖提取率的計算

將提取干燥后的多糖溶解，定容于250 mL的容量瓶中，取1.0 mL多糖溶液，依次快速加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃H2SO4，混合均勻后用于比色測定迅速搖勻，室溫放置30 min，于波長490 nm處測吸光值。根據葡萄糖標準曲線建立回歸方程算出竹筍多糖含量，然后按以下公式計算出麻竹筍多糖提取率:

式中:m為多糖質量，mg;m1為竹筍粉末的質量，mg。

1.3.5 麻竹筍多糖紅外光譜分析

對提取的竹筍多糖經過脫蛋白、透析脫鹽、干燥壓片后于紅外光譜儀上進行紅外光譜掃描，然后進行數據分析。

1.3.6 實驗數據分析處理方法

使用 Origin8.6、EXCEL以及響應面分析軟件(Design Expert 8.0.7)進行相關圖表的繪制和數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同超聲時間對多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲時間的增加，超聲波空化作用加強，細胞壁破碎程度加大，竹筍多糖提取率不斷升高，在20 min時達到最大值，當超聲波提取時間超過20 min時，多糖提取率反而逐漸降低，這可能是因為持續的長時間超聲作用會使液體過熱，使得多糖大分子鏈在超聲波的剪切作用下發生破壞和斷裂，而小分子的糖在醇沉處理過程中發生損失，從而降低多糖的得率［19］。因此，超聲時間應該選擇20 min左右為佳。

圖1 不同超聲功率對竹筍多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different ultrasonic power on the extraction rate of bamboo shoot polysaccharides

2.1.2 不同超聲功率對多糖提取率的影響

從圖2可知，在功率120～360 W內，超聲功率越強，則多糖提取率越高。當功率大于360 W，多糖提取率逐漸降低，其原因可能是超聲波的機械空化作用導致分子之間的摩擦加劇，碳碳鍵斷裂而引起多糖降解，最終導致多糖提取率的降低［21］，所以超聲功率選取240～480 W較適宜。

圖2 不同超聲功率對竹筍多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different ultrasonic power on the extraction rate of bamboo shoot polysaccharides

2.1.3 不同超聲溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知，在超聲溫度在40～50℃，隨著溫度的不斷升高，麻竹筍多糖提取率不斷提高，溫度在50℃時，多糖提取率達到最大，而隨后隨著溫度的繼續升高提取率下降，這可能是因為在較高溫度下，超聲波的空化作用和高溫破壁效應導致多糖在胞外受到破壞進而分解，這一結果與邵信儒等［18］和張桂等［27］的試驗結果相一致。因此，超聲波輔助提取竹筍多糖的溫度選擇在45～55℃較好。

圖3 不同超聲溫度對竹筍多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic temperatures on the extraction rate of bamboo shoot polysaccharides

2.2 響應面優化麻竹筍多糖提取工藝

2.2.1 中心組合試驗

根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，依據單因素試驗結果，以超聲時間、提取功率和提取溫度作為主要因素，設計三因素三水平響應面分析試驗。共有17個試驗點，其中12個為分析因子，5個為零點。零點試驗進行5次，以估計誤差。中心組合試驗方案及結果如表2所示。

表2 響應面(RSA)試驗設計和試驗結果Table 2 Experimental results of RSA

根據表2中的數據使用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合分析，得到模型的擬合曲線方程為:Y=2.39+0.11A+0.14B+0.095C-0.11AB-0.12AC+0.043BC-0.23A2-0.21B2-0.076C2。

同時對模型進行了回歸系數和方差分析的顯著性檢驗，分析和檢驗結果見表3。

表3 響應面方差分析二次模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface model analysis of variance table

由表3的方差分析可知，該模型的Prob＞F的值為0.001 6，小于0.05，表明該模型的回歸方程具有顯著性。超聲功率對多糖提取率有極顯著影響，超聲時間和超聲溫度有顯著影響，各因素對多糖提取率影響大小順序為超聲功率＞超聲時間＞超聲溫度，并且超聲時間與超聲功率、超聲時間與超聲溫度對多糖提取率的交互作用達到顯著水平。

2.2.2 響應面分析因素之間的交互作用

圖4為超聲溫度50℃條件下，超聲時間和超聲功率的交互作用對麻竹筍多糖提取率的影響。由圖4可知，超聲功率的提高和超聲處理時間的延長都能使多糖得率增加，并且在低水平條件下，提取率變化較大;在高水平條件下，提取率變化較慢，并且2個因素的交互作用顯著，但是2個因素達到一定條件后提取率下降，這是可能是由于超聲時間的延長和超聲功率的提高使得糖鏈斷開，變為寡糖或單糖，造成多糖提取率下降。

圖4 超聲波時間和功率對提取率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of yield versus time and power of ultrasonic pretreatment

圖5為在超聲功率360W條件下，超聲時間和超聲溫度的交互作用對麻竹筍多糖提取率的影響。由圖5可知，超聲溫度和時間在較低水平時，提取率變化較大;當2因素處于中間水平時，提取率趨向于最高，說明兩因素交互作用顯著。在相同超聲時間下，升高溫度并不會一直提高多糖提取率，這可能是由于溫度的升高，溶液中分子熱運動加劇，在超聲波的作用下，細胞被破壁后出現裂縫，兩者相互作用使得多糖迅速溶出，但溶出后的多糖在超聲波作用下發生部分降解，導致提取率下降。

圖5 超聲波時間和溫度對提取率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of yield versus time and temperature of ultrasonic pretreatment

圖6為在超聲30 min條件下，超聲功率和溫度的交互作用對麻竹筍多糖提取率的影響。由圖6可知，超聲功率和溫度在較低水平時，提取率變化較大;當兩因素處于中間或者較高水平時，提取率趨向于最高，說明兩因素交互作用不顯著。當超聲功率或者超聲溫度在較高水平時都能使提取率達到最大。

圖6 超聲波功率和溫度對提取率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of yield versus power and temperature of ultrasonic pretreatment

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗證

利用Design Expert 8.0軟件，綜合考慮麻竹筍多糖提取率和實驗可操作性等因素，得到最優超聲工藝為超聲時間 29 min，超聲功率 400 W，超聲溫度55℃，在此條件下多糖提取率的預測值分別為2.51%。采用上述最優工藝條件進行驗證，重復實驗3次，實際測定值為(2.47±0.04)%，與預測值接近，說明該超聲輔助工藝條件的可靠性和準確性。而本課題組前期試驗采用水提醇沉法提取麻竹筍多糖，提取時間一般要在1 h以上，提取溫度為80℃以上，提取率最高為2.19%，與之相比較，超聲波輔助提取時間縮短50%以上，提取溫度降低，大大提高了提取效率。

2.3 麻竹筍多糖紅外光譜分析

由圖7可知，在3 600～3 200 cm-1(3 412 cm-1)出現一個較強的寬峰，為羥基(—OH)的伸縮振動;在2 926 cm-1處吸收峰為甲基、亞甲基和次甲基等的C—H伸縮振動峰，1 400～1 200 cm-1(31 395 cm-1)處的峰是C—H的變角振動。這2組峰為多糖的特征吸收峰，這一鑒定結果與孫利芹等［28］對紫球藻多糖的紅外光譜分析結果相一致。而1 641 cm-1處吸收峰為羰基，1 026 cm-1處吸收峰為常見的吡喃型糖環，說明麻竹筍多糖具有一般多糖在紅外光譜中的特征性結構。因此，紅外光譜分析結果表明通過超聲輔助提取分離的物質為麻竹筍多糖物質。

圖7 竹筍多糖的紅外分析Fig.7 Infrared spectrum of crude polysaccharides extracted from bamboo shoot

3 結論

通過響應面法優化超聲波輔助提取麻竹筍多糖的最佳提取工藝條件為:超聲時間29 min、超聲功率400 W、超聲溫度55℃，在此條件下多糖提取率預測值為2.51%，驗證值為2.49%，與預測值接近。與水提醇沉法相比，超聲波輔助提取時間縮短50%以上，提取溫度降低，大大提高了提取效率。同時，紅外光譜分析證明通過超聲輔助提取分離的物質為麻竹筍多糖物質。

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